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1.
为了解贵州地区禽腺病毒血清4型(FAdV-4)分离株的致病性和生物学特性,本研究对经PCR检测为FAdV-4核酸阳性的肝脏样本应用鸡肝癌细胞(LMH)进行FAdV-4分离培养,通过观察FAdV-4感染细胞病变,并应用PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、电镜等技术对分离病毒进行鉴定;然后通过动物感染试验分析分离病毒的致病性。结果显示,FAdV-4核酸阳性肝脏接种LMH细胞后在72 h出现细胞病变,对LMH细胞具有一定的适应性,盲传5代肝脏样本接种细胞经PCR检测,呈FAdV-4阳性;IFA检测显示FAdV-4感染LMH细胞见有绿色荧光,FAdV-4细胞培养物经电镜观察可见有大量病毒粒子的存在。上述表明,本研究分离获得FAdV-4,将其命名为FAdV-4-GZJS。动物感染试验证实,该病毒能引起鸡胚和雏鸡出现心包积液、肝炎等临床病例所表现的典型症状;荧光定量PCR检测,感染雏鸡肝脏部位FAdV-4含量最高,心包积液次之。FAdV-4贵州株分离鉴定及其生物学特性和致病性的分析,为该病原致病机制研究奠定基础。 相似文献
2.
《中国畜牧兽医》2020,(7)
为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术(LFD),优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病病毒(MDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H9亚型(AIV(H9))、禽呼肠孤病毒(ARV)、FAdV标准株(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)、鸡大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(SA)、鸡白痢沙门氏菌(SP)、鸡毒支原体(MG)的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4℃条件下至少可以保存3个月,在-20℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%(21/117)。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。 相似文献
3.
为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。 相似文献
4.
为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型（FAdV-4）检测试剂盒，本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针，并在下游引物标记FITC，探针标记Biotin，应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术（LFD），优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法，并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明，此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4，而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克病病毒（MDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭瘟病毒（DPV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒H9亚型（AIV（H9））、禽呼肠孤病毒（ARV）、FAdV标准株（FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11）、鸡大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（SA）、鸡白痢沙门氏菌（SP）、鸡毒支原体（MG）的检测结果均为阴性。敏感性试验表明，此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融，依然有很好的检测效果。保存期试验证实，试剂盒在4 ℃条件下至少可以保存3个月，在-20 ℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化，简化了操作流程，提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示，FAdV-4阳性率为17.95%（21/117）。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查，对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。 相似文献
5.
为了对禽腺病毒4型(FAdV-4)引发的鸡心包积水-肝炎综合征的病原学监测和疫情诊断提供技术支撑，本研究经对部分发表在NCBI的禽腺病毒4型序列进行比对，在其六邻体基因上找到一段相对保守序列，并设计出PCR引物和TaqMan探针。以FAdV-4 HB1510株作为标准品，通过反应条件优化，建立了FAdV-4荧光定量PCR检测方法，并对其敏感性、特异性和重复性进行了分析。结果显示，该方法的灵敏度为10 EID50/mL,为常规PCR方法的10倍；组内和组间重复性良好；与鸡减蛋综合征病毒、大肠杆菌等禽类病原的核酸无交叉反应。通过对65份临床样品进行检测，FAdV-4荧光定量PCR和常规PCR的检测符合率为90.7%。因此，FAdV-4荧光定量PCR的快速、敏感、特异等优点使其在禽腺病毒4型的早期检测及预防、控制等方面有较好的应用前景。 相似文献
6.
以4型禽腺病毒(FAdV-4)的DNA为模板,扩增其六邻体(hexon)部分基因并进行重组表达,以重组hexon蛋白为包被抗原,优化ELISA检测条件,建立了FAdV-4的ELISA抗体检测方法。该方法对FAdV-4阳性血清检测为阳性,对于其他鸡常见病毒,如禽流感病毒5、7、9型,新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒阳性血清检测均为阴性;与PCR方法的阳性符合率为83.3%。试验表明,建立的以重组hexon蛋白为包被抗原检测FAdV-4血清抗体的ELISA方法可以用于检测FAdV-4的感染及相关流行病学调查。 相似文献
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为建立禽腺病毒4型(FAdV-4)特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的编码基因克隆于pET-32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的Fiber2蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化,建立了一种检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法。结果:该方法可以特异地检测抗FAdV-4抗体,与新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、H5和H9亚型禽流感病毒等常见禽病毒的抗血清均无交叉反应,表明所建立ELISA具有较好的特异性;FAdV-4阳性血清经1?3 200稀释后检测结果仍为阳性,表明所建立ELISA方法具有较高的敏感性;所建立ELISA的批内和批间重复试验的变异系数分别为1.5%～5.2%和1.1%～5.6%,表明其重复性良好。应用建立的ELISA方法对河南省及周边部分地区养禽场内FAdV-4的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区养禽场均存在不同程度的FAdV-4型抗体阳性,平均阳性率为59.53%。由此表明本研究所建立的ELISA方法可以用于FAdV-4感染的监测和流行病学调查。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2019,(1):41-45
为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。 相似文献
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《中国家禽》2017,(19)
近年血清4型禽腺病毒(Serotype 4 fowl adenovirus,FAdV-4)在国内鸡群流行,给养鸡业带来了巨大经济损失。目前尚无针对FAdV-4特异性单克隆抗体的制备及其应用报道。研究通过将FAdV-4全病毒免疫小鼠,以纤突蛋白2原核表达产物为筛选抗原,研制出了4株针对FAdV-4的单克隆抗体,分别命名为3C2、4A6、5C4、5H6。间接免疫荧光试验证明4株单克隆抗体不与所检测的血清8型禽腺病毒反应,也不与FAdV-4的纤突蛋白1反应,仅与FAdV-4的纤突蛋白2反应,并且单克隆抗体3C2在体外能有效抑制FAdV-4的感染。4株抗FAdV-4纤突蛋白2单克隆抗体的成功获得为研制FAdV-4快速诊断试剂盒及探究纤突蛋白2在FAdV-4致病机制中的作用奠定了基础。 相似文献
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【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约103 TCID50/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。 相似文献
13.
为了解禽腺病毒血清4型（FAdV-4）地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株（GZ-BJ株和GZ-QL株）的全基因序列,长度分别为43 352、43 723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF（22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42）,二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。 相似文献
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为了解禽腺病毒血清4型(FAdV-4)地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株(GZ-BJ株和GZ-QL株)的全基因序列,长度分别为43352、43723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42),二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。 相似文献
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Routine batch control of licensed inactivated viral vaccines for poultry usually includes a potency assay as a measure of vaccine efficacy. Potency assays often consist of vaccination-challenge experiments in the target species or in laboratory animals. Instead of measuring the protection of vaccinated animals against virulent pathogens, the serological response after vaccination can be quantified for some vaccines. In vitro antigen quantification assays would be attractive alternatives for the current potency assays because the time and costs involved could be greatly reduced and animal use could be avoided. Such in vitro assays will only be acceptable when the correlation between results and efficacy or potency has been demonstrated convincingly. The results of our studies on antigen quantification assays indicate that, in principle, quantification of viral antigens from inactivated oil-adjuvanted vaccines is feasible and reproducible using specially developed antigen capture ELISAs in combination with specific software for statistical analysis of the ELISA data. We have developed methods to quantify the haemagglutination-neuraminidase (HN) and fusion (F) proteins of Newcastle disease virus (NDV), the viral protein 3 (VP3) of the infectious bursal disease virus (IBDV), and the spike-1 (S1) protein of the infectious bronchitis virus (IBV). Vaccination experiments with inactivated ND vaccines indicate that the in vitro quantified HN- or F-proteins of NDV are reliable indicators of the serological response after vaccination. 相似文献
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2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了解山东省禽腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料（肝脏、脾脏）进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞（LMH）进行毒株传代培养和细胞病变（CPE）观察、PCR检测、TCID50测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500 bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID50分别为10-7.75/0.1 mL和10-7.60/0.1 mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高（99.57%）,第2分离株与FAdV-8b株同源性最高（99.18%）。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒（HEV）所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒（EDSV）所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。 相似文献
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P.A. Maas M.P.M. de Winter S. Venema H.L. Oei I.J.T M. Claassen 《The Veterinary quarterly》2013,33(4):223-227
Abstract Routine batch control of licensed inactivated viral vaccines for poultry usually includes a potency assay as a measure of vaccine efficacy. Potency assays often consist of vaccination‐challenge experiments in the target species or in laboratory animals. Instead of measuring the protection of vaccinated animals against virulent pathogens, the serological response after vaccination can be quantified for some vaccines. In vitro antigen quantification assays would be attractive alternatives for the current potency assays because the time and costs involved could be greatly reduced and animal use could be avoided. Such in vitro assays will only be acceptable when the correlation between results and efficacy or potency has been demonstrated convincingly. The results of our studies on antigen quantification assays indicate that, in principle, quantification of viral antigens from inactivated oil‐adjuvanted vaccines is feasible and reproducible using specially developed antigen capture ELISAs in combination with specific software for statistical analysis of the ELISA data. We have developed methods to quantify the haemagglutination‐neuraminidase (HN) and fusion (F) proteins of Newcastle disease virus (NDV), the viral protein 3 (VP3) of the infectious bursal disease virus (IBDV), and the spike‐1 (S1) protein of the infectious bronchitis virus (IBV). Vaccination experiments with inactivated ND vaccines indicate that the in vitro quantified HN‐ or F‐proteins of NDV are reliable indicators of the serological response after vaccination. 相似文献