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1.
为研究化脓隐秘杆菌致病机制及其病原学诊断方法,本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因,并构建重组表达质粒pET-plo,转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中诱导表达.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组蛋白约为62 ku,western blot分析表明表达的重组蛋白可以与鼠抗化脓隐秘杆菌血清发生反应.采用重组蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶128 000,western blot和琼脂双扩散试验表明制备的多克隆抗体能够与天然PLO蛋白发生反应.溶血试验表明重组蛋白能够溶解红细胞,制备的多克隆抗体能有效中和重组蛋白的溶血活性. 相似文献
2.
《中国兽医学报》2019,(6):1151-1156
为研究多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的免疫原性,本试验利用PCR从牛源A型多杀性巴氏杆菌HB01基因组中扩增了TbpA的编码基因tbpA,并将其克隆至原核表达载体pET-30α(+)上,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,rTbpA蛋白成功表达。Western blot证实该蛋白能够与抗多杀性巴氏杆菌HB01血清发生阳性反应。将rTbpA免疫小鼠后,分别于免疫后14,28 d采血,利用ELISA试验检测血清中的抗体滴度,结果显示血清中的抗rTbpA蛋白的IgG抗体显著升高(P0.05)。感染试验结果显示,免疫rTbpA蛋白能够保护70%的小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的致死性攻击,并且病理切片结果表明,免疫小鼠的肺部损伤相对于对照组小鼠显著降低。本试验为筛选新型的多杀性巴氏杆菌免疫原性蛋白提供依据。 相似文献
3.
参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。 相似文献
4.
为体外表达牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PlpE基因及制备抗PlpE蛋白多克隆抗体,根据PlpE基因核酸序列设计了1对特异性引物,通过PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE;摇菌提取质粒,进行双酶切鉴定,鉴定正确后将重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导,对诱导蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定;使用纯化蛋白PlpE免疫北京大耳白兔,制备多克隆抗体,并进行间接ELISA和Western Blot分析。结果显示,扩增的PlpE基因大小为1 050 bp,在原核细胞中诱导表达的PlpE蛋白约56 kDa。间接ELISA结果显示,所制备多克隆抗体效价可达1:512 000;Western Blot结果显示,所制备多克隆抗体反应性良好。PlpE蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为下一步多杀性巴氏杆菌诊断方法的建立和疫苗研发奠定了基础。 相似文献
5.
牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2019,(6):1075-1079
为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。 相似文献
7.
裂谷热(Rift Valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的一种烈性人兽共患传染病。RVFV囊膜蛋白Gn可诱导产生中和抗体,是RVFV检测方法和疫苗研究的重要抗原靶标。本研究通过分析蛋白抗原位点信息,构建包含Gn蛋白两个主要抗原区域的重组表达载体,随后将质粒转化至BL21感受态细胞,以IPTG诱导重组蛋白表达并优化蛋白表达条件,通过Western Blot鉴定重组蛋白;将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并以ELISA、Western Blot、IFA检测多克隆抗体的反应性。结果显示:诱导表达的Gn重组蛋白分子质量约为45 kDa;蛋白表达条件优化为IPTG终浓度0.25 mmol/L,诱导时间5 h;Western Blot鉴定发现蛋白成功表达。通过ELISA测定小鼠三免后血清抗体,结果发现抗体效价大于1:51200;Western Blot检测显示,制备的多抗血清能与重组蛋白发生反应;进一步的IFA检测结果表明,制备的多克隆抗体可与真核质粒转染细胞中表达的Gn蛋白反应。本研究获得的Gn重组蛋白及制备的多克隆抗体为后续RVFV检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
8.
禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。 相似文献
9.
《中国动物传染病学报》2019,(6)
多杀性巴氏杆菌是危害多种畜禽和野生动物的重要病原并可造成人类发病。OmpH(包括OmpH1和OmpH2)是巴氏杆菌细胞壁中的一种主要外膜蛋白,过去对OmpH致病作用的研究主要集中于OmpH1,而有关OmpH2的报道较少。本研究对OmpH1和OmpH2一级结构进行了比较,发现OmpH2一级结构上具有多个与OmpH1高度相似的局部区域。采用原核表达系统表达了rOmpH2,进而开展了Western blot、Far Western blot和招募抑制实验。OmpH2与巴氏杆菌感染康复血清发生了特异性反应。OmpH2能够结合宿主Fn和Plg,而且OmpH2多克隆抗体能够显著抑制多杀性巴氏杆菌对Fn和Plg的黏附。本研究表明OmpH2能够在多杀性巴氏杆菌结合宿主Fn和Plg的过程中发挥作用,增加了多杀性巴氏杆菌毒力因子和分子致病机制的认识,对巴氏杆菌病防控具有重要意义。 相似文献
10.
试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。 相似文献