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1.
在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素 总被引：1，自引：0，他引：1
为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础. 相似文献
2.
本研究合成了编码CaIFN-α蛋白的基因片段,分别与温度诱导表达载体pBV220和化学诱导表达载体pET20b连接,构建了pBV220-CaIFN-α和pET20b-CaIFN-α重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21,通过温度诱导和IPTG诱导表达,CaIFN-α蛋白表达量分别为25%和20%。对比两方法诱导表达结果,确定最佳诱导方法为温度诱导。表达菌经超声破碎、变性、复性、疏水层析和分子筛层析后,得纯化的CaIFN-α蛋白,纯度约为96%。利用MDCK(犬肾细胞)-VSV(水疱性口炎病毒)体系,测定纯化后CaIFN-α蛋白的生物学比活性为3×107U/mg。 相似文献
3.
重组犬α2干扰素的原核表达及其抗病毒活性评价 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在构建犬α2干扰素(CaIFN-α2)大肠杆菌表达系统,并进行优化和筛选,评价其表达的重组犬α2干扰素的抗病毒活性。根据GenBank中CaIFN-α2的基因序列,按大肠杆菌密码子偏好性对CaIFN-α2全基因序列进行优化与合成,连接至pET-32a表达载体中,构建pET-32a-CaIFN-α2重组表达质粒。设计1对含NdeⅠ/BamHⅠ酶切位点的特异性引物,克隆CaIFN-α2成熟肽基因,连接至pET-21a表达载体中,构建pET-21a-CaIFN-α2重组表达质粒。将两种重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物均以包涵体形式存在。表达菌经超声破碎、变性、复性和分子筛层析后,得到纯化的CaIFN-α2蛋白,纯度约为90%。采用细胞病变抑制法在MDCK-VSV系统中测定其抗病毒活性,结果显示,纯化后pET-32a-CaIFN-α2蛋白的抗病毒活性为1.5×103IU/mL,而纯化后pET-21a-CaIFN-α2蛋白的抗病毒活性高达1.0×107IU/mL。本试验结果表明CaIFN-α2在pET-32a及pET-21a载体系统中均能成功表达,且具有抗病毒活性,但在pET-21a载体系统中表达产物的活性更高,试验结果为进一步开发和利用犬干扰素制剂奠定了基础。 相似文献
4.
试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。 相似文献
5.
犬α干扰素的克隆、表达及纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
根据DDBJ/GenBank基因库中已登录的犬α干扰素序列,设计了含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采取聚合酶链式反应(PCR)技术以犬基因组DNA为模板进行了CaIFN-α的成熟肽基因的克隆,扩增产物与克隆载体pGEM-T Easy Vector连接后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定和EcoRⅠ酶切鉴定,初步证实为CaIFN-α,用SphⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将目的片段与表达载体pQE30连接,然后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定、SphⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、序列测定证实已经成功克隆了CaIFN-α,构建了重组表达质粒PQE30/CaIFN-α。将重组表达菌液培养至OD600为0.5时加入IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析CaIFN-α在大肠杆菌中得到了表达,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,表达量约占细菌总量的20%左右。将诱导表达的菌液经超声裂解、变性、复性、透析后,得较纯的CaIFN-α蛋白。本研究为以后CaIFN-α的活性及临床应用研究奠定了基础。 相似文献
6.
《中国畜牧兽医》2016,(10)
根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
7.
为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。 相似文献
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9.
《畜牧与兽医》2016,(9):1-6
比较3种含不同个数基序肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor,PA)的结合活性。首先应用PCR技术分别扩增得到含有1个、2个和3个自溶素基序(Lysin Motif,Lys M)基因片段的PA、PA2与PA3;然后应用含纳米抗体(nanobody,Nb)基因的重组质粒p ET-28a(+)-Nb构建原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL-21(DE3),进行诱导表达,获得目的蛋白;最后将可溶性的PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb融合蛋白与GEM(Gram-positive enhancer matrix)颗粒结合,经Western blot与SDS-PAGE进行结合鉴定与结合活性比较分析。试验结果显示裂解后可溶性的融合蛋白PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb都能与GEM颗粒结合,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性明显好于PA-Nb,PA2-Nb的表达量和可溶性明显优于PA3-Nb,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性与PA3-Nb相当。本研究可为进一步完善乳球菌外壳-蛋白锚钩展示系统提供理论依据。 相似文献
10.
用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。 相似文献
11.
根据Genbank的犬干扰素仪序列,经密码子优化后,设计并合成了编码CalFN-仪蛋白的基因片段。CaIFN-0l基因与pBV220温度诱导表达载体连接,转化大肠杆菌BL21。经培养、升温诱导表达,目的蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为18000,蛋白表达量为25％。菌体经超声破碎、变性、复性后,目的蛋白纯度为69％,收率为28％;疏水层析后,目的蛋白纯度87％,收率为81％;分子筛层析后,目的蛋白纯度为96％,收率为90％。纯化的CalFN-o蛋白的生物学比活性为3×10’IU／mg,内毒素≤10EU／mg,符合兽用药要求。此制备工艺总产率高达20％、重现性好,适用于大规模生产。 相似文献
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MA Chang-jiao ZHENG Jia-qi HUANG Hai-bi WANG Xiao-hui BAI Fan HAO Yong-qing 《中国畜牧兽医》2017,44(2):371-376
In order to analyze the immunological characteristics of lipid-associated membrane protein p60 of Mycoplasma ovipneumoniae, we cloned the N-terminal part and C-terminal part of p60 gene by PCR separately. The overlap-extension PCR was used to mutagenate nucleotides TGA (1 459－1 461 bp) to TGG. Then the PCR product was inserted to the pET-32a(+) plasmid for expression in E.coli BL21(DE3). The purified recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE, and the recombinant N-terminal domain of p60 protein was successfully expressed with a mass of molecule of 57 ku, and a molecular of 30.5 ku of the N-terminal domain of p60 protein. Western blotting revealed that the two kinds of proteins could specifically react with positive serum, which confirmed that the recombinant N-terminal domain of p60 protein and the recombinant C-terminal domain of p60 protein both had a good reactionogenicity. This study could provide an effective reference data for screening important immunogenicity protein and establishment available diagnosis methods. 相似文献
13.
为分析绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）膜表面脂蛋白p60的免疫学特性,本研究分别扩增p60蛋白N端与C端的基因,并通过重叠延伸PCR将C端基因序列中的TGA（1 459－1 461 bp）定点突变为同义密码子TGG。将扩增的基因片段分别插入到pET-32a（+）表达载体上,重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,得到分子质量约57 ku的p60-N蛋白和分子质量约为30.5 ku的p60-C蛋白;再对纯化后的重组蛋白进行 Western blotting 分析,结果表明重组蛋白均可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,表明表达的重组蛋白p60-N和p60-C均有良好的反应原性。本研究为筛选MO主要的免疫原性蛋白和建立特异的血清学诊断方法提供了依据。 相似文献
14.
本研究根据酵母系统密码子的偏嗜性,对成熟蛋白基因核苷酸序列进行密码子偏嗜性改造,利用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC来表达犬IFN-α成熟蛋白基因。并采用非洲绿猴肾细胞(Vero) -水疱性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法为基础来测定重组犬α干扰素的效价,同样方法测定了表达产物对PRV和CDV的抑制作用。本试验实现了犬α干扰素在酵母中的高表达,表达量高达58 mg/L,SDS-PAGE检测大小约为24 ku,比预测分子质量大,推测发生了糖基化。表达产物具有较强的种属特异性,在Vero细胞上对PRV具有较高的抗病毒活性,达到了3.6×107 U/L,对CDV也有很好的抑制作用。本研究为犬IFN-α以后的临床应用研究奠定基础。 相似文献
15.
Immunogenic and antigenic properties of recombinant soluble glycoprotein of rabies virus 总被引：2，自引：0，他引：2
Gupta PK Sharma S Walunj SS Chaturvedi VK Raut AA Patial S Rai A Pandey KD Saini M 《Veterinary microbiology》2005,108(3-4):207-214
Rabies virus glycoprotein is a type I transmembrane protein exposed on the surface on the mature virus particle that induces virus neutralizing antibodies. In the present study, 60 amino acid C-terminal hydrophobic anchor (transmembrane) and cytoplasmic domains of glycoprotein were deleted from full-length glycoprotein and fused with polyhistidine tag. The N-terminal viral signal peptide was also replaced with CD33 signal peptide for efficient secretion in mammalian cells. Following transfection of Madin Darby bovine kidney (MDBK) cells with plasmid encoding this soluble form of glycoprotein, polyclonal populations of stably transfected resistant cells were obtained after G418 selection. The protein was expressed as a glycosylated protein and secreted outside the cells utilizing N-terminal CD33 signal peptide. The secreted soluble glycoprotein was purified from cell culture supernatant by Ni--agarose affinity chromatography utilizing C-terminal polyhistidine tag. Like full-length glycoprotein, the expressed recombinant soluble glycoprotein was found to be immunogenic when injected in rabbits. In this study, we have assessed the potential of recombinant soluble glycoprotein as diagnostic antigen in ELISA and found that this recombinant protein can be used as diagnostic antigen in ELISA for detecting anti-glycoprotein antibodies in immunized host. 相似文献
16.
猪α干扰素具有抗病毒作用,临床上具有广阔的应用前景.为获得重组猪α干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪α干扰素基因插入供体质粒pFastBac~(TM) Ⅰ多克隆位点,置于pH启动子控制下,在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化.将重组转移栽体质粒转化DH10感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blotting证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达.镍亲和层析柱纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳相对分子质量为19 000.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测其抗病毒活性为9.67×10~4 U/mL.昆虫培养上清及细胞裂解液经2~8稀释在Mare-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒增殖.从而为进一步作为抗病毒药物应用于猪疫病的防治研究奠定了基础. 相似文献
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为鉴定胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)ApxIA毒素蛋白N端疏水区和C端Ca~(2 )结合区的免疫原性,参照apxIA基因序列(D16582)设计4条引物,用于扩增APP血清10型参考菌株(D13039)基因组DNA中长约3.2kb的apxIA基因及其N端(1.4kb)和C端(1.8kb)基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体DET-32a中进行表达,表达的融合蛋白大小分别约为125Ku、65Ku和80Ku。表达产物免疫小鼠后的攻毒保护试验结果显示,ApxIA表达蛋白对APP血清10型(D13039)攻毒可提供完全保护,而对APP血清1型(4074)攻毒仅能提供部分保护,与提纯的ApxⅠ毒素蛋白免疫保护效果相当;ApxIA-N端表达蛋白免疫保护活性显著高于ApxIA-C端表达蛋白,提示ApxIA蛋白免疫活性位点多位于N端,在ApxⅠ毒素蛋白的保护性抗原活性中发挥更重要作用 相似文献
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UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段（UL36USP）,本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21（DE3）E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。 相似文献