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本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。 相似文献
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利用虎红平板法和试管凝集反应,对采自乌兰县铜普镇、希里沟镇、柯柯镇和茶卡镇4个镇的奶牛血清249份,1630份种公羊血清,进行布氏杆菌病血清抗体的监测,对检出的阳性和可疑血清通过复检,最终掌握牛羊布氏杆菌病的感染情况,有的放失地采取综合防治。 相似文献
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为探究免疫增强剂CVC1302诱导机体产生高亲和力抗体的免疫机制,本研究利用4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白(NP-OVA)与免疫增强剂CVC1302配伍后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗。将33只6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组,分别后腿肌肉注射NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL疫苗,50 μg NP-OVA/只,利用ELISA检测高亲和力NP特异性抗体水平;利用流式细胞仪分析生发中心B细胞增殖水平、生发中心 B细胞诱导活化的胞苷脱氨酶(AID)表达水平;利用荧光定量PCR检测AID基因和HoxC4基因转录水平。结果表明:1)免疫增强剂CVC1302可诱导小鼠产生高亲和力的NP特异性抗体。2)免疫增强剂CVC1302可显著提升抗原特异性生发中心 B细胞数量占总B细胞数量比例。3)免疫增强剂CVC1302可显著增加生发中心 B细胞HoxC4基因转录水平。4)免疫增强剂CVC1302可显著增强生发中心B细胞AID蛋白表达水平。生发中心B细胞表达的AID可针对B细胞免疫球蛋白序列可变区进行点突变,发生体细胞高频突变,提升B细胞BCR针对抗原的亲和力,进而在辅助性T细胞的阳性选择下分化为长寿浆细胞,持续性分泌高亲和力抗体,因此本研究推断免疫增强剂CVC1302依赖于正向调控AID诱导机体产生高亲和力抗体,为机体提供免疫保护力,以抵抗病原体的感染,为后续新型免疫增强剂的研制提供思路和理论基础。 相似文献
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[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。 相似文献
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[目的]本研究旨在比较活/灭活病毒进入体内后对免疫系统活化的差异，为免疫增强剂的筛选和评价建立高效动物模型。[方法]本试验利用伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株建立小鼠伪狂犬人工感染模型，筛选活/灭活病毒接种小鼠后免疫相关差异因子。将PRV Bartha-K61活毒以不同剂量、不同方式感染小鼠，通过计算小鼠存活率确定最佳感染剂量与感染方式；将筛选的最佳剂量的伪狂犬病毒活毒与相同剂量下灭活病毒按照前述筛选的最佳感染方式接种小鼠，利用ELISA试剂盒检测免疫7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6水平；利用PRV gB ELISA检测免疫7 d后小鼠血清PRV特异性gB抗体水平；利用灭活PRV作为特异性抗原进行淋巴细胞增殖试验并计算各组淋巴细胞刺激指数(SI)。[结果]在保证小鼠存活的前提下，6～8周龄小鼠的PRV的安全感染剂量为5×104 TCID50;同等剂量下，相比于肌肉和腹腔注射，皮下注射为最安全的感染方式；同等剂量的活毒和灭活病毒接种小鼠后，与灭活病毒组相比，活病毒感染7 d后小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平显著... 相似文献
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为开发一种新型高效、低成本的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)抗原纯化方法，本研究尝试了一种基于凝集素(刀豆蛋白A，Con A)的PEDV浓缩纯化方法。通过Con A与PEDV病毒粒子的特异性结合，形成Con A-PEDV复合物，然后通过低速离心和竞争性解离即可实现病毒纯化。结果表明:1)当Con A的使用浓度为80 μg/mL，室温作用2 h，4 000 r/min离心15 min时，纯化效果较佳；2)利用Tris-HCl缓冲液(pH 7，0.01 mol/L，内含200 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L NaCl)进行解离时，较PBS缓冲液有更高的解离效率；3)该方法病毒回收率大约为80%，总蛋白去除率可达90%。综上，本研究利用Con A纯化PEDV是可行的，为高质量PEDV灭活疫苗的研发奠定基础。 相似文献
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为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。 相似文献