猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达     

崔青  孙晓林  王生富  房永祥  陈国华  曾爽  景志忠 《甘肃农业大学学报》2010,45(6)

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.  相似文献   

猪CD8β分子重组蛋白的表达、纯化与免疫活性鉴定   总被引：1，自引：1，他引：0  

薛萍  孙晓林  王晓霞  陈国华  房永祥  景志忠 《甘肃农业大学学报》2009,44(4)

对猪CD8β(pCD8β)基因重组蛋白的表达纯化条件以及免疫活性进行了研究.结果表明:pET-28a-pCD8β重组菌诱导表达产物的分子量约为24 ku,与预计的分子量大小相符.包涵体形式表达的重组蛋白的纯化产物经免疫印迹分析和ELISA检测证实有良好的特异性反应;SDS-PAGE后的目的胶带以直接研磨法和电洗脱纯化法加佐剂分别免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测抗原免疫效价均大于1∶6 400,说明本试验对pET-28a-pCD8β纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,可以制备CD8β的单克隆抗体.  相似文献   

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达   总被引：3，自引：1，他引：2  

郭爱疆  才学鹏  贾万忠  房永祥  乔军  刘红霞  潘小梅  景志忠 《中国农业科学》2009,42(7):2572-2578

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。  相似文献   

猪MyD88基因的克隆及其结构预测分析     

曾爽  房永祥  陈国华  景志忠 《动物医学进展》2010,31(5):1-5

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从猪的脾脏淋巴细胞中克隆了猪MyD88基因(pMyD88)。基因序列分析表明,克隆的pMyD88基因含一个完整的开放阅读框(ORF),大小为882 bp,共编码293个氨基酸,分子质量33.28 ku,A+T=41.38%,G+C=58.62%。DNA Star软件分析发现,与GenBank上登载的猪AB292176核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.5%和100%,与其他物种的核苷酸序列同源性均在80%以上,说明MyD88基因在各物种间相对保守,在遗传系统发生上亲缘关系密切。对猪MyD88蛋白分子的结构预测发现,α-螺旋占41.3%,伸展结构占14.33%,无规则卷曲占44.37%;存在N端的死亡区和C端的Toll区两个结构域,表明MyD88是Toll受体的关键接头分子。  相似文献   

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应   总被引：1，自引：0，他引：1  

景志忠  蒙学莲  窦永喜  陈国华  房永祥  黄银君  王超英  刘西兰  张军  才学鹏 《畜牧兽医学报》2009,40(6)

作者应用含CpG基序序列的重组质粒(即CpG DNA)作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果.结果表明:CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍.CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照;与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照(PD50> 4.69).在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗(50、200μg·头份-1)都比高剂量组(500 μg·头份-1)诱导的抗体滴度高,其中50和200μg·头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14～32 d诱导的抗体滴度高达1:1 500,是标准疫苗的4～5倍,而500μg·头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应.研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔.  相似文献   

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

何延华  景志忠  陈国华  房永祥  蒙学莲  李小庆  段风云  王生富 《中国预防兽医学报》2009,31(8)

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.  相似文献