猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的间接ELISA检测     

谢碧林  李超美  王芳  宋艳华  何孔旺 《江苏农业科学》2013,41(1):40-42

为了建立快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)抗体的间接ELISA方法,将质粒pET-rApxⅡ转化至BL21,IPTG诱导表达毒素rApxⅡ融合蛋白,经亲和层析纯化后的蛋白作为检测抗原.对ELISA各检测条件进行优化,结果显示,抗原最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80.用建立的ELISA方法对猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪副嗜血杆菌、大肠杆菌阳性血清进行检测,均无交叉反应.利用建立的ELISA方法从172份临床血清样本中检测出84份阳性血清样本,而利用Cps-ELISA试剂盒检测到74份阳性样品,本方法检测总符合率达83％.  相似文献   

六种中药生物碱对LPS作用下猪血管内皮细胞分泌细胞因子的影响     

胡屹屹  何孔旺  王小敏 《北京农学院学报》2011,26(3):41-43

通过研究6种中药生物碱对细菌内毒素（LPS）作用下猪血管内皮细胞分泌细胞因子血栓素B2（TXB2）,内皮素-1（ET-1）和E-选择素（E-selectin）的影响,拟探讨生物碱抗LPS的药理作用机制。培养猪血管内皮细胞至单层融合状态,加入LPS刺激,3 h后加入高、中、低3种浓度的6种中药生物碱青藤碱、防己诺林碱、水苏碱、川芎嗪、苦参碱和吴茱萸碱,继续培养21 h后收集细胞上清液,用ELISA测定TXB2,ET-1和E-selectin的含量。结果,水苏碱高剂量组和川芎嗪高剂量组的TXB2含量极显著低于LPS对照组,川芎嗪中剂量组和吴茱萸碱高剂量组显著低于LPS对照组;苦参碱高剂量组的ET-1含量极显著低于LPS对照组,青藤碱高剂量组显著低于LPS对照组;防己诺林碱高剂量组和吴茱萸碱中剂量组的E-selectin含量显著低于LPS对照组。结果提示六种中药生物碱具有明显的抗细菌内毒素作用,可在由TXB2,ET-1和E-selectin介导的机体凝血、休克和炎症等病理损伤过程中发挥治疗作用。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白主要抗原位点在昆虫细胞中的表达     

李菁  何孔旺  杨倩 《南京农业大学学报》2009,32(1)

用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达.  相似文献   

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

潘群兴  何孔旺  温立斌  郭容利  黄克和 《南京农业大学学报》2009,32(1)

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.  相似文献   

类猪圆环病毒因子P1感染对猪红细胞的影响   总被引：6，自引：1，他引：5  

温立斌  何孔旺  杨汉春  倪艳秀  张雪寒  俞正玉  茅爱华 《内蒙古农业科技》2009,(2):46-48

探讨类猪圆环病毒因子P1感染后,广西巴马小型猪发生贫血的类型,推断贫血发生的原因。12头30日龄的猪随机分成两组,每组6头,试验组经腹股沟淋巴结途径接种P1分子克隆。采用自动血液分析仪对接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血进行红细胞各参数检测。统计分析结果显示P1感染后,与对照组相比,红细胞参数之间无差异的指标有RBC、HGB、HCT、MCV和MCHC等5项,而MCH在接种后17d明显降低,而RDW在31d增高明显。可见,猪感染类猪圆环病毒因子P1可导致小细胞低血色素性贫血。  相似文献   

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1   总被引：3，自引：0，他引：3  

温立斌  何孔旺  杨汉春  郭容利  周俊明  钟书霖 《华北农学报》2009,24(4)

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.  相似文献   

非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果   总被引：2，自引：0，他引：2  

孙小涵  张碧成  张强  何孔旺  张雪寒 《中国农业科学》2017,50(9):1714-1722

【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白,用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性,按照5μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗,同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组,皮下接种Balb/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便,45 d后取小肠后段,采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度,用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)抗体滴度,以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE和Western blot分析表明,4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性,融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明,疫苗经皮下注射接种后,单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平,而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组,IgG滴度高,并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外,LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中,当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时,血清中IgG滴度大幅增高,且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳,显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明,黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性,皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水平,显示其具有良好的应用前景。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性   总被引：2，自引：0，他引：2  

唐芳  何孔旺  侯继波  姜平 《农业生物技术学报》2009,17(1):1-6

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。  相似文献   

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究     

白文霞  鲍恩东  侯继波  何孔旺 《猪业科学》2004,21(8):51-53

15个江苏省IBDV分离株,对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序,得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列,构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明,15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行,且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。  相似文献   

PCR定量方法概述   总被引：3，自引：0，他引：3  

宋敏  胡建民  何孔旺 《上海畜牧兽医通讯》2005,(2):18-19

聚合酶链式反应(Polynlerase Chain Reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR技术自诞生之日起就决定了它不仅是一种检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行定量分析的有力工具。  相似文献