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本研究采用PCR技术扩增了鹅和番鸭全长细小病毒基因;其中鹅和番鸭细小病毒非结构蛋白基因（NS）全长为1884bp,编码627个氨基酸;结构基因（VP）全长为2199bp,编码732个氨基酸;序列分析表明：鹅和番鸭细小病毒NS之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80．9％～82．9％和89．5％～91．2％,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为93．7％～99.8％和96．8％～99．7％,番鸭细小病毒之间的同源性为98．8％～99.8％和98.6％～99．5％;在核苷酸和氨基酸水平上,鹅和番鸭细小病毒VPI之间的同源性分别为79．7％～88．7％和85．5％～93．3％,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为88．8％～99．6％和91．5％～99.2％,番鸭细小病毒之间的同源性为98．1％～99．6％和97．1％～98．8％;番鸭和鹅细小病毒NS和vp1基因的系统进化树分析表明：番鸭和鹅呼细小病毒来自共同的祖先,但随着宿主的不同而演化为不同的分支。 相似文献
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为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应. 相似文献
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经RT—PCR扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因，将其克隆到pFastBacH—TA载体上，酶切鉴定及测序筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC；将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR筛选获得重组转座子rBacmid—σC。在脂质体介导下将rBacmid—σC转染sf-9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV—σC；SDS—PAGE和Western blot分析表明：在sf-9细胞中表达了分子量约37kD的σC蛋白，并且该蛋白能与原核表达σC蛋白免疫小鼠制备的血清发生特异免疫反应，为今后以表达的σC蛋白作亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达 总被引：4，自引：0，他引：4
将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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将鸭呼肠孤病毒小外壳dC蛋白编码基因克隆于原核表达栽体pET32a上，经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析，获得了重组质粒pET32a-σC，转化DH5a大肠埃希氏菌感受态细胞后，经SDS—PAGE和Western—blotting分析，融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应；以0．15mmol／L IPTG诱导，5h后融合蛋白σC表达量可达高峰，分子质量为50ku；融合蛋白纯化后被用作包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA，经对检测条件优化，最佳包被浓度为5μg／mL，标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与琼脂扩散抗体检测法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性。 相似文献
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为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。 相似文献
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为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。 相似文献
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为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。 相似文献
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2015年11月14日至12月14日,黑龙江省某县多个村从外县购入的牛发生不明原因的急性死亡。发病牛主要表现呼吸道症状,从发病到死亡的时间为几小时到数天不等,病死牛剖检可见严重肺炎病变。为揭示疫病暴发的主要病因,提供防控建议,结合现场流行病学调查和实验室诊断,对该次疫情开展了调查。调查结果显示:此次疫情波及6个村,发病牛多为1岁左右;时值气候寒冷;疫情发生前1周左右,有牛调运史。实验室诊断结果显示,采集的样本中均含有未分类的曼氏杆菌,其对氨苄西林和环丙沙星耐药,而对头孢曲松敏感。最终确认本次疫情是由牛群调运、寒冷气候和年龄等风险因素相互作用,诱发曼氏杆菌的内源性感染所致。 相似文献