STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内存活的影响     

席静  王月丽  邓肖玉  杨琴  李培东  张江伟  孙天浩  朱良全  易继海  陈创夫 《畜牧兽医学报》2022,53(1):263-271

旨在探讨STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内生存的影响。本研究采用布鲁氏菌光滑株S2308（S2308）和粗糙型疫苗株RB51（RB51）侵染巨噬细胞。利用qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β,M2型巨噬细胞标志因子STAT6、ARG1、IL-10的mRNA表达水平;流式细胞术检测M1型标记分子CD86和M2型标记分子CD206的表达;Western blot检测p-STAT6蛋白及抑制剂AS对蛋白的抑制作用;ELISA检测M1型细胞因子TNF-α、IL-12和M2型细胞因子IL-4、IL-10的表达量;最后对胞内菌落进行CFU计数。qRT-PCR结果显示,在感染8、12 h时可显著诱导M1型因子mRNA转录表达,72 h时低表达,而M2型因子在72 h时高表达;流式细胞术结果显示,S2308感染12 h可显著诱导CD86的表达,感染72 h可显著诱导CD206的表达,但RB51对二者无影响;Western blot结果显示,S2308菌株在感染72 h时激活STAT6信号通路,而RB51几乎不激活该通路,抑制剂AS在2 μmol·L^-1浓度时抑制效果最佳;ELISA结果显示,AS抑制剂可显著抑制IL-4、IL-10的释放,并促进TNF-α、IL-12的释放;CFU计数结果显示,S2308组的胞内菌呈先降低后显著上升趋势,加入AS抑制剂后可显著抑制布鲁氏菌胞内复制。布鲁氏菌S2308在感染后期能够通过STAT6诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,并促进Th2型细胞因子的释放,从而有利于布鲁氏菌的胞内生存。而RB51几乎不激活该通路,不影响胞内生存。  相似文献   

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析     

刘庆庆  吴鹏  李培东  张江伟  陈创夫  肖陈诚 《中国畜牧兽医》2022,49(3):1024-1031

【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列（登录号：KT945017.1）,人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX （delta） E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID₅₀,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）为10^-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著（P<0.05）,其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。  相似文献   

牛布鲁菌侵染对HPT-8细胞p38基因转录水平的影响     

韩玉霞  王震  张倩  孙志华  刘娟  张辉  陈创夫 《动物医学进展》2015,(4):1-6

探讨布鲁菌侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)过程中对p38基因转录的影响。用牛布鲁菌2308和RB51株分别侵染HPT-8细胞,在不同侵染时间点(0、4、8、12、48h)收集细胞,提取总RNA,反转录获得cDNA;构建p38α、p38β和内参基因GAPDH的克隆质粒,并绘制3种基因扩增的标准曲线;RT-qPCR检测p38α和p38β基因的转录表达。结果显示,获得了HPT-8细胞侵染前后的cDNA,构建了pMD18-T-p38α/p38β/GAPDH克隆质粒,绘制了标准曲线。RT-qPCR结果显示,布鲁菌2308和RB51侵染滋养层细胞后(4、8、12、48h),p38α和p38β的相对表达量比0h均明显下降,差异极显著(P0.01),布鲁菌RB51株和2308株也存在一定差异。结果表明,在布鲁菌侵染HPT-8细胞的过程中,p38 MAPK信号通路被下调,提示p38 MAPK信号通路参与了对细胞生物学效应的调控,且这种调控作用与菌株的毒力强弱存在密切联系。  相似文献   

布鲁氏菌LPS对小鼠巨噬细胞中NLRP3炎症小体转录水平的影响     

袁莎  陈鹏博  陈创夫 《中国畜牧兽医》2015,42(1):9-16

为研究布鲁氏菌LPS对巨噬细胞中NLRP3炎症小体的影响,本试验提取布鲁氏菌2308、RB51和△WbkA的LPS,以不同浓度与小鼠巨噬细胞相互作用,荧光定量PCR检测其对NLRP3、ASC、Caspase1、IL1-β、IL18转录水平的影响。结果显示RB51LPS和△WbkA LPS上调NLRP3炎症小体相关基因的转录水平,且呈浓度依赖性,而浓度对2308LPS调节NLRP3炎症小体相关基因转录的作用不大;且同一浓度下,RB51LPS和2308LPS比△WbkA LPS更好的调节Caspase1、IL1-β、IL18的转录水平。  相似文献   

细粒棘球蚴TSP1和TSP6基因的克隆及生物信息学分析     

刘田莉  孟庆玲  乔军  陈诚  马玉  胡政香  才学鹏  陈创夫 《华北农学报》2015,(2)

为了研究绵羊细粒棘球蚴重要抗原基因Tetraspanin 1-TSP1(TSP1)和Tetraspanin 1-TSP6(TSP6)的功能,对Gen Bank中Eg基因组数据库检索,获得TSP1和TSP6的c DNA序列并设计特异性引物。以Eg头节为总RNA模板,进行RT-PCR,将PCR产物克隆到p MD19-T载体后测序并进行生物信息学分析。TSP1 c DNA全长792个核苷酸,编码263个氨基酸,该多肽含有3个潜在的N端糖基化位点,2个N端酰基化位点,与已登录的标准株TSP1基因序列(EG_11043)同源性为98.99%,其推导的氨基酸序列同源性为98.48%;TSP6 c DNA全长666个核苷酸,编码221个氨基酸,该多肽含有5个N端酰基化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,与已登录的标准株TSP6基因序列(EG_00715)同源性为98.18%,其推导的氨基酸序列同源性为85.07%。运用分子生物学软件对Eg TSP1和TSP6基因进行生物信息学分析,预测已知序列的蛋白质抗原的结构和表位,为疫苗的研发奠定了前期基础。  相似文献   

重组轮状病毒多抗原表位的克隆、表达及植物表达载体的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

王琦  祝建波  陈创夫 《西北农业学报》2006,15(5):145-149

为了研制基于表位的轮状病毒亚单位疫苗,用PCR的方法得到RV(Rotavirus RV)VP4的抗原表位编码序列,并人工合成了RV VP7的3个抗原表位编码序列,通用辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)氨基酸序列和破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)上的一个T细胞激活位点[1,2],各位点间以非极性的甘氨酸和脯氨酸分隔以保持各表位的相对独立性,使用搭桥法PCR(Over lapextension PCR)、酶切、连接等基因工程的方法将各个表位片段串联拼接在一起,组合成一条轮状病毒(RV)多表位抗原基因,将其转入原核载体质粒pTHioHis B,在大肠杆菌DH5a克隆,并在BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与预期结果相符;重组蛋白经轮状病毒快速检测试剂盒检测有抗原性。将此多表位抗原基因插入高效植物表达载体pE1802,为研制重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。  相似文献   

融合蛋白VP4-STI的免疫效果观察     

武军元  陈创夫  王智超  李有文 《安徽农业科学》2007,35(21):6436-6437,6446

为了研究融合蛋白VP4-STI的免疫效果。将40只小鼠随机分为实验疫苗组(30μg VP4-STI+0.6μg LTB)、铝胶疫苗组[30μg VP4-STI+Al(OH)3胶]、纯化蛋白VP4-STI疫苗组(30μg VP4-STI)和PBS对照组,通过鼻腔滴入进行免疫,测定其抗体水平。用大肠杆菌强毒株C83902进行攻毒试验,观测各免疫组小鼠的保护效果。除PBS对照组外,其余各组均有抗VP4-STI抗体产生,第6周最高,铝胶疫苗组的抗体水平略高于实验疫苗组,纯化蛋白VP4-STI免疫组较低,与实验疫苗组差异极显著(P<0.001)。实验疫苗组和铝胶疫苗组小鼠对大肠杆菌强毒株C83902均有较好的免疫保护效果,与对照PBS组有明显差异。该研究为进一步提高STI的免疫原性提供了依据。  相似文献   

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建     

武冬梅  祝建波  陈创夫  王琦  张金波 《西北农业学报》2006,15(5):150-154

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。  相似文献   

布鲁氏菌M5-90△WboA基因缺失株的构建及免疫效果的初步评价   总被引：2，自引：1，他引：1  

张艳  陈创夫  张辉  张沾  李志强  张俊波  孟仁  王震 《中国预防兽医学报》2011,33(7)

为获得毒力较弱并能区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究用PCR方法扩增WboA基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pGEM-7zf-△WboA-Sac,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选布鲁氏菌疫苗株M5-90的WboA基因缺失株,并对获得的M5-90△WboA遗传稳定性、毒力、免疫保护性、抗体水平等指标进行检测.实验结果表明M5-90△WboA株的毒力比M5-90株明显减弱,差异极显著(p＜0.01),体液免疫和细胞免疫结果表明M5-90△WboA株与亲本M5-90株相比差异不显著(p＜0.05),M5-90△WboA株和亲本株的保护率分别为10％和20％,表明M5-90△WboA株与M5-90株具有相似的保护性.凝集试验和western blot试验显示M5-90△WboA株免疫小鼠的血清反应结果为阴性.本研究构建的布鲁氏菌基因缺失株M5-90△WboA具有较好的遗传稳定性,毒力比亲本株更弱,免疫保护性与亲本株相当,并能以血清学检测方法区分野毒株感染和缺失疫苗株免疫的动物.  相似文献   

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库的构建与鉴定     

张国奇  李尤简  肖红冉  黄美玲  杨霞  陈创夫  盛金良 《西北农业学报》2015,24(3):20-25

通过构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驼源重链抗体文库,并鉴定抗体文库的多样性,为筛选抗BVDV特异性重链抗体奠定基础。利用灭活的BVDV免疫双峰驼,多次免疫后测定血清抗体滴度,采集免疫后的血液并分离其外周淋巴细胞,抽提RNA,用RT-PCR法扩增重链抗体可变区(VHH)片段;将其克隆至载体pCANTAB5E,电转大肠杆菌TG1获得VHH抗体基因库,检测抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体文库多样性。结果表明,所构建的抗体文库的库容量为4.32×105;测序和聚类分析表明,抗体文库多样性丰富。利用辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库,测定滴度达1.3×1012 cfu/mL。  相似文献