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[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近. 相似文献
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为H9与H6亚型禽流感病毒(AIV)的监测及其防控提供技术支撑,依据Genbank中H9和H6亚型AIV的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立并优化可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的三重RT-PCR检测方法,并对所建方法进行特异性、敏感性及临床样品检测验证。结果表明:三重RT-PCR反应的最佳体系为2×PCR Mix 12.5μL,H9与H6亚型AIV cDNA共2μL为模板,特异性引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL,特异性引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)及H6-F和H6-R(20pmol/μL)的加入量分别为0.7μL和1μL,用RNA-free水补足至终体积为25μL,退火温度53℃。该方法可在一个反应管内同时鉴别检测H9与H6亚型AIV,特异性强,敏感性高,可推广应用。 相似文献
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根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。 相似文献
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屠宰猪肠道沙门氏菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验 总被引：2，自引：0，他引：2
为了解广西南宁市猪源沙门氏菌的污染状况、耐药状况及致病力情况,在南宁市某生猪屠宰场随机直接从131头屠宰猪的肠道采集样品,采用鉴别培养基分离,生化鉴定的方法对样品中的沙门氏菌进行分离鉴定,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行25种抗生素敏感试验,最后对分离株进行小白鼠致病性试验。结果从131份屠宰猪的肠道中共分离到沙门氏菌45株,检出率为34.35%;其中鼠伤寒沙门氏菌14株,甲型副伤寒杆菌2株,肠炎沙门氏菌3株。45株分离菌株全部耐药,耐药率高达100%,其中44株为多重耐药菌株,占97.78%。45株沙门氏菌中有40株对小白鼠具有致病性,致病率达88.89%。这表明南宁市的屠宰猪存在一定程度的沙门氏菌污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象以及具有较强的致病性。应采取有效措施控制沙门氏菌在猪群中的污染和限制抗生素在养猪过程中的使用并严格遵守休药期,以减少细菌耐药性的产生,保障猪肉及猪肉制品的食品安全。 相似文献
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8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为103,102,101拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为104,103,102,101拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为101拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在103拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。 相似文献
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旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好... 相似文献
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为了研究绿猴肾(Vero)细胞中禽呼肠孤病毒(ARV)的增殖特性,试验采用了光学显微镜观察、半数组织感染量(TCID50)测定、RT-PCR检测等方法对细胞培养物进行了研究。结果表明:ARV S1133毒株在Vero细胞中能有效增殖,并出现细胞破碎、萎缩、抱团、脱落、边缘模糊、胞体变大,甚至死亡等典型的细胞病变(CPE);RT-PCR检测成功扩增出一条大小为1 248 bp的条带;ARV在感染Vero细胞后会经历三个时期,即潜伏期、快速增长期、稳定期,并在稳定期病毒效价达到峰值,TCID50为1×10~(-8.46)/0.1 m L。 相似文献
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【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组(空白对照组和3个感染组)。感染组每组以100μL稀释至106EID50/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量(EID50)在10-6.0/0.2 mL~10-6.8/0.2 mL,半数致死量(ELD50)在10-6.8/0.2 mL~10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同器官中的滴度及分布存在一定差异;感染SPF鸡后均未表现出明显的临床症状和死亡现象,但在上呼吸道的气管及肺脏出现一定程度的充血和出血、气管纤毛脱落及炎性淋巴细胞浸润等病变。3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1~7 d,且能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒;3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡各器官中的复制能力存在一定差异,可在气管和肺脏中进行有效复制,而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。【结论】麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染鸡群且具有在鸡群间水平传播的潜在风险,提示在家禽饲养、运输及销售等环节要做好相关的防护措施,切断AIV在野鸟与家禽间的传播途径,减少禽流感暴发造成的经济损失。 相似文献
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旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列，筛选了特异性探针引物组，采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化，并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较，同时对其他常见禽病病原体进行检测，以及对40份临床样品进行检测，评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍，最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测，结果均为阴性；批内和批间重复性较好，变异系数小。结果表明，所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性，可成功用于快速定量检测ChPV感染。 相似文献
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旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)的方法，并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列，在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列，应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法，并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示，建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果，本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，且无交叉反应。灵敏性结果显示，本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线，其曲线呈良好的线性关系(R2=0.999 4),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测，结果... 相似文献