刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达     

陈媛媛  张守发  于龙政  常巧呈  薛书江 《中国预防兽医学报》2008,30(1):21-25

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。  相似文献   

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达     

许瑞勤  郭嘉  魏凤灵  冯延  马思续  张留君  李想通  李闻  孙杨杨  杨国宇  夏平安  张改平 《中国兽医学报》2019,(4):609-614,621

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。  相似文献   

NLRP3炎症复合体的体外构建     

石玉华  郑梦洁  徐伟  师福山 《中国兽医学报》2019,(4):735-738,750

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。  相似文献   

羊口疮病毒B2L基因密码子偏好性分析     

张静  陈翠英  李静静  张七斤 《中国动物检疫》2019,36(8):100-103

B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的主要囊膜蛋白,为重要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对B2L基因运用Visual Gene Developer生物信息学软件,分析其在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性,从而选择一个最适表达系统,以增加B2L蛋白的表达量。分析表明,B2L基因在昆虫杆状病毒表达系统中会得到更好的表达,这为B2L基因表达系统的选择提供了参考。  相似文献   

宿主防御肽在奶牛乳腺中的表达及应用     

王可鑫  王鑫  姜宁  张爱忠 《动物营养学报》2019,31(5):2038-2044

宿主防御肽是生物体内产生的一类具有抗菌作用的阳离子多肽,是生物体非特异性免疫功能的重要组成部分。宿主防御肽具有广谱、抗菌、耐热、无毒、不易产生耐药性等诸多特性,在畜牧生产中具有广阔的应用前景。本文主要对宿主防御肽在先天免疫系统中的作用、奶牛乳腺中的表达及乳房炎诊断与治疗应用的研究进展进行综述,为宿主防御肽作为抗生素替代品在畜牧生产中的研究与应用提供理论支持。  相似文献   

鸭补体调节因子H的原核表达及多克隆抗体制备     

王向丽  李德龙  谷九龙  刘海兰  孟雅娜  陈思怀  唐发书  李继祥 《动物医学进展》2019,40(8):40-43

为制备鸭补体调节因子H(CFH)的多克隆抗体,从健康雏鸭的肝脏组织中提取总RNA及反转录合成cDNA,PCR扩增补体调节因子H基因的2个片段H1和H2,插入到载体pMD19-T,测序正确后,将目的基因分别克隆至原核表达载体pCold-TF,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE检测,镍柱亲和层析纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果表明,成功构建重组表达质粒pCold-TF-H1和pCold-TF-H2,SDS-PAGE检测重组蛋白为可溶性表达,TF-H1和TF-H2多克隆抗体效价均超过1∶10000。所制备的多克隆抗体可以为进一步研究鸭CFH的功能奠定基础。  相似文献   

小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立     

孙雨  宋晓晖  董浩  赵柏林  曲萍  蒋菲  杨天意  张晨  杨林  王传彬 《动物医学进展》2019,40(4):1-8

通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。  相似文献   

猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

樊钰莹  华思红  王志鹏  孙永科  杨玉艾 《动物医学进展》2019,40(1):7-11

炎症小体不仅参与机体的天然免疫反应,同时还参与机体抗病毒等多种宿主防御反应。在多种疾病相关信号通路反应中都伴随着蛋白质的泛素化修饰。NOD样受体(NLRs)介导的炎症小体信号通路中,凋亡相关点状样蛋白(ASC)是关键的接头蛋白。为了解猪瘟病毒(CSFV)感染对ASC泛素化水平的影响,通过RT-PCR从猪血管内皮细胞(ECs)中扩增获得ASC和泛素(Ub)的全长cDNA双链片段,连接至克隆载体pMD-18T,获得重组克隆质粒pMD-ASC和pMD-Ub。双酶切pMD-ASC获得ASC目的序列,连接至pcDNA3.1-Flag,双酶切pMD-Ub获得Ub目的序列,连接至pcDNA3.0-HA,获得重组表达质粒pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub。将pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub转染ECs,Western blot在蛋白水平检测ASC和Ub的表达。结果表明,成功构建了带有Flag标签的ASC真核表达质粒和带有HA标签的Ub真核表达质粒,且在ECs中获得高效表达,为进一步体外研究CSFV调控猪血管内皮细胞ASC泛素化的机制提供了实验基础。  相似文献   

猪波形蛋白的原核表达及其对口蹄疫病毒浸染PK-15细胞的作用     

令瑛  马雪青  李平花  张婧  李坤  付元芳  冯若飞  马忠仁  卢曾军  刘在新 《动物医学进展》2019,40(1):12-19

为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。  相似文献   

驴内脏组织中脂肪沉积相关基因的差异表达     

刘迥  王艳萍  孟维钊  田方  曾维斌 《动物医学进展》2019,(2):87-90

脂肪沉积相关基因在动物内脏中的异常表达与某些疾病相关。应用RT-qPCR技术分别检测2岁~3岁健康公、母新疆驴内脏器官心、脾、肾、肝、小肠、大肠和肺中脂肪沉积相关基因H-FABP、PLIN1、LPL、HSL、PPARγ和FASN的表达差异。结果显示,新疆驴内脏器官中脂肪沉积相关基因的表达,性别对基因的差异表达影响较小;在各组织间,H-FABP基因在心脏、PLIN1基因在肝脏组织中的表达都显著的高于其他组织;LPL、HSL基因在心脏、肾脏的表达量较高;PPARγ基因在脾、肺中表达最高,而FASN基因在心、脾中表达最低。研究结果可为新疆驴内脏器官有关疾病的监测与预防提供一定的参考。  相似文献