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51.
NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。 相似文献
52.
【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114 bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170 mg?L-,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9 cm和2.2 cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH 6.0),每24 h补加2%甲醇,29℃培养72 h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。 相似文献
53.
本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。 相似文献
54.
本研究目的是利用毕赤酵母细胞表面展示技术来改善内切-1,4-β-葡聚糖酶的酶学性质。结果显示,SDS-PAGE显示展示酶(DEG)的分子量为34.1kDa,对CMC-Na有底物专一性。与游离酶(FEG)相比,DEG的最适作用温度和最适作用pH值未发生变化,分别为70℃和4.0;对底物的亲和力降低;pH 2.5~8.5时酶活残留率为60%,比游离酶高0.5倍;温度70℃时酶活无损失,残留率为102%,同等条件下比游离酶高1.5倍;DEG重复使用10次以后保留活性仍为65%;而且展示酶对Co2+、Mn2+、Hg2+等重金属离子的耐受力也大大增强。本研究结果表明,展示内切-1,4-β-葡聚糖酶的酶学性质得到大幅度改善,其酸热稳定性、重金属离子耐受性和操作稳定性均有所提高,DEG作为一种酵母全细胞生物催化剂在各种纤维素降解领域具有很广阔的应用前景。 相似文献
55.
根据Genebank上登录的鸡的myostatin基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物,并分别在两引物前设计两个酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ,克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定后,构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m,经测序鉴定,结果表明所克隆的myosta-tin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡（AF019621）、猪（AY208121）和家鹅（AF440862）的MSTN-m核酸序列同源性分别可达到99%、92%、86%,但翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100%、99.1%及99.1%。 相似文献
56.
采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中亚克隆出IL-18基因并完成了真核融合表达载体pPIC9K-IL-18的构建和IL-18在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、pH值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18的发酵工艺.结果表明,摇瓶发酵时,诱导最佳时间为72 h,甲醇最适浓度为20 g/L,最适pH范围为6.0~8.0,最适接种量1∶1.与单纯甲醇诱导相比,甘油/甲醇诱导后的表达量明显提高. 相似文献
57.
用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性. 相似文献
58.
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。 相似文献
59.
60.
重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验 总被引：3，自引：0，他引：3
用由毕赤酵母表达的皮蝇素A（Hypdermin A，HA）蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛，了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，3周后抗体水平达到峰值，后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好，差异非常显著（P〈0．01）。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛，观察感染率和感染强度，ELISA测其抗体消长规律。结果表明，7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83．3％和36．3％（对照组为55．5％）；平均感染强度分别为6．5和4．2（对照组为13．0），差异不显著（P〉0．05）。免疫后，抗体水平上升，3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好，三组抗体水平差异非常显著（P〈0．01）。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。 相似文献