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利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。 相似文献
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鹌鹑β-防御素10基因的克隆与表达及其体内分布的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为测定鹌鹑β-防御素10 (AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8％).将该基因亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中进行原核表达,SDS-PAGE电泳表明,鹌鹑AvBD10重组蛋白分子量约为31ku.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性,结果显示,鹌鹑AvBD10重组蛋白具有广谱的抗菌活性.采用定量RT-PCR法检测到AvBD10在鹌鹑脏器组织中广泛表达. 相似文献
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将山羊IFN-γ基因插入到合有口蹄疫病毒（FMDV）vp1基因的山羊痘病毒（GPV）转移载体PTK-vp1中,获得合有FMDV vp1基因和山羊IFN-γ基因的重组转移载体pTK-vp-IFNγ,以本实验室构建的表达β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的山羊痘重组病毒rAY41-LacZ为亲本毒,与转移载体pTK-vp-IFNγ共同转染犊牛睾丸细胞进行同源重组,通过7轮反向蓝白斑筛选,产生重组山羊痘病毒rAY41-VP-IFNγ,通过PCR和间接免疫荧光实验证实获得了能够稳定表达FMDV vp1和山羊IFN-γ的重组山羊痘病毒。 相似文献
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中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析 总被引：5，自引：1，他引：4
本研究应用RT—PCR方法扩增到我国2005年-2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK／CH／LSD／05I与疫苗株H120同源性最高（93.4％）。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株（9株）分布于第1群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK／CH／LSD／05I存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年-2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。 相似文献
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抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBV N蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和western blot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合. 相似文献
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采取2005年大连某鸡场发病鸡群萎缩的输卵管进行处理,经鸡胚尿囊腔接种SPF鸡胚,分离到1株病毒。通过致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率等方面的研究,发现病毒经鸡胚传毒至第3代可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲且大腿及尾部有点状出血;病毒囊液不凝集鸡的外周血红细胞;在电镜下呈球形,病毒囊膜表面有疏松排列的棒状纤突,具有冠状病毒粒子的形态特征;以105.5×EID50/0.1mL的病毒接种15日龄的SPF雏鸡,鸡群发病率为22/22(100%),死亡率为12/22(54.5%)。根据以上结果确定该病毒为冠状病毒,命名为CK/CH/LDL05Ⅱ。在此基础上,用RT-PCR对CK/CH/LDL05Ⅱ的核蛋白基因进行了克隆、测序和分析。与GenBank中26株IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较分析,发现该毒株与我国2004年分离IBV毒株CK/CH/LDL/04Ⅱ的N基因推导氨基酸同源性最高(97.5%),表明两者具有较近的亲缘关系。这一结果不但从分子水平证实毒株CK/CH/LDL05Ⅱ是鸡传染性支气管炎病毒,而且表明该血清型的毒株最近连续2年... 相似文献
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【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。 相似文献
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本研究从2008山东表现神经症状的某新城疫疫苗免疫鸡群中分离到一株病毒。通过鸡红细胞凝集试验和血凝抑制试验,表明为新城疫病毒,将其命名为ck/CH/LSD/08-29。根据GenBank上登录的新城疫病毒基因组序列,设计14对引物经过RT-PCR扩增病毒感染的尿囊液,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。结果表明,该毒株基因组由15186个核苷酸序列组成,编码6种结构蛋白,在RNA上的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。F基因裂解位点处的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点。通过F基因裂解位点附近高变区389个核苷酸序列构建遗传进化树,证明该毒株在分类地位上属于基因Ⅱ型。此外,病毒感染SPF鸡试验证明ck/CH/LSD/08-29毒株属于强毒嗜神经型毒株,能引起SPF鸡高致死率。 相似文献
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为建立呼肠孤病毒(RV)的三维模型,本研究利用冷冻电镜(cryo-EM)单颗粒三维重构技术获得了分辨率为10.6(A)的果子狸RV MPC/04株的三维结构.三维重构结果显示,果子狸RVMPC/04株具有哺乳动物RV典型的形态.该病毒由内外两层衣壳蛋白组成,呈二十面体对称结构.内衣壳的外面包裹着一层由200个μ13σ33异源六聚体复合物构成的外衣壳,三角形剖分函数T=13.同时我们还观察到了该病毒主要蛋白之间的连接方式.本研究探讨为不同宿主的RV的形态和结构比较研究提供了相关的数据. 相似文献