鸭源NF-κB1基因荧光定量PCR方法建立及其初步应用     

张飘  贺欣薇  杨霞  曾茂芹  刘妍罕  张扬子  杨颖  温贵兰  程振涛  文明 《浙江农业学报》2021,33(2):215

为建立鸭NF-κB1(nuclear factor-kappa B, NF-κB)基因的荧光定量PCR检测方法,并以建立的方法检测鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblasts , DEF)在感染鸭肠炎病毒(DEV)后NF-κB1基因随时间变化转录表达量的变化情况。根据GenBank 上NF-κB1基因保守序列设计特异性引物,以鸭胚成纤维细胞 mRNA提取样本反转录为cDNA,进行NF-κB1基因克隆质粒构建,以此为模板建立鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法并进行特异性、重复性和敏感性试验,并利用建立的方法DEF感染DEV后NF-κB1基因随时间变化的转录变化进行检测。结果显示:建立的鸭NF-κB1基因荧光定量PCR方法标准曲线呈现典型的S型,方程为y=-3.12x+44.086(R²=1),扩增效率为109.2%;其熔解温度Tm值为(83.5±0)℃,曲线呈特异性单峰,批内变异系数小于0.3%,批间变异系数小于0.2%;检测灵敏度可达到1.79个拷贝。DEF细胞在感染DEV后NF-κB1基因随时间改变转录水平变化无规律,但整体表达水平高于正常细胞,差异显著(P<0.05),36~84 h NF-κB1基因的转录水平与正常细胞中差异极显著(P<0.01)。本研究成功建立了鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法,并对DEF细胞感染DEV后NF-κB1基因的转录水平进行了研究,为后续实验研究提供了技术和数据支撑。  相似文献   

雏鸭鸭疫里默氏杆菌与Wautersiella falsenii杆菌混合感染的诊断     

陈广  温贵兰  张喜懿  田浪  杨佰启  陈国权  周碧君 《贵州农业科学》2020,48(3):90-93,封3

为雏鸭鸭疫里默氏杆菌(RA)与Wautersiella falsenii杆菌混合感染的诊断与治疗提供参考,对贵州安顺某鸭场1月龄疑似RA感染的4只病鸭进行临床症状观察、病理剖检、细菌分离鉴定、16SrRNA序列分析及药敏试验。结果表明:病鸭临床症状为精神沉郁、采食量少、神经症状明显、卧地不起、拉灰白色水便;病鸭心脏、肝脏和脾脏有纤维素性病变,并伴有心包积液;无菌分离出GZRA2019和GZWF2019革兰氏阴性杆菌株,分别为鸭疫里默氏杆菌和W.Falsenii杆菌;鸭疫里默氏杆菌对头孢呋辛、氨苄西林、青霉素等7种抗生素耐药,对多西环素、四环素和头孢哌酮3种抗生素敏感;W.Falsenii杆菌对头孢他啶、青霉素、头孢氨苄等10种抗生素耐药,对多西环素、四环素和头孢哌酮3种抗生素中度敏感。该养鸭场存在鸭疫里默氏杆菌和W.Falsenii杆菌混合感染。  相似文献   

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达   总被引：1，自引：1，他引：0  

温贵兰  张升波  李昌红  徐丽  田浪  文明  王开功  程振涛  赵德刚 《中国畜牧兽医》2019,46(1):10-19

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta，IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象，提取肝脏总RNA并反转录为cDNA，设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区，将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上，获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β，并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析；将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明，从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp，编码186个氨基酸；该蛋白为分泌性蛋白，前21个氨基酸为信号肽序列；二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%，与禽的同源性最低（35.2%）；从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%，但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%，存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示，带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别，条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。  相似文献   

斑点叉尾鮰源致病性维氏气单胞菌的分离与生物学特性鉴定     

田浪  温贵兰  张升波  杨佰启  李昌红  徐丽  林汉卿  管国丹 《中国畜牧兽医》2018,45(11):3203-3210

为鉴定一起致斑点叉尾鮰突然发病死亡的病原，本研究从发病斑点叉尾鮰中分离到1株致病菌GZTL2017，通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、动物回归试验、生化试验、16S rDNA序列分析、部分毒力基因检测和药敏试验进行鉴定。临床解剖观察结果显示，患病斑点叉尾鮰呈现体表溃疡、鳍根部出血、烂腮、肠管充血等症状；分离菌在培养基中呈现表面湿润凸起、边缘光滑半透明、形态均一的乳白色菌落；革兰氏染色镜检显示，分离菌为单个或成双存在、两端钝圆的短直阴性杆菌；动物回归试验显示，该分离菌有较强的致病性；生化试验结果显示，分离菌具有运动性，且氧化酶、V-P、赖氨酸脱氢酶等反应阳性，精氨酸双水解酶、硫化氢等反应阴性；16S rDNA基因序列系统进化树显示，该菌与维氏气单胞菌聚为一支，同源性均>99%；毒力基因检测结果显示，该菌能检出气溶素基因（Aer）、黏附素基因（Aha）、外膜蛋白基因（OmpA）3种毒力基因；药敏试验结果显示，该菌对氟苯尼考、强力霉素、氧氟沙星等14种药物敏感；对诺氟沙星、新霉素、万古霉素等7种药物中度敏感；对麦迪霉素、苯唑西林、头孢拉定等8种药物耐药，且对氟苯尼考、强力霉素的药物最小抑菌浓度分别为1和2 μg/mL。本试验成功分离到1株维氏气单胞菌，为斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病防治提供参考依据。  相似文献   

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析     

温贵兰  陈绍品  张升波  林汉卿  管国丹  王开功  文明  周碧君  程振涛  赵德刚 《中国畜牧兽医》2018,(6)

试验旨在研究从江香猪γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ(CJ-poIFN-γ)基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(50.60%)和无规则卷曲(33.14%)为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。  相似文献   

从江香猪EDC3基因的克隆及其在不同组织中表达的分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

李昌红  温贵兰  张升波  徐丽  林汉卿  田浪  杨佰启  管国丹  汪德生 《中国预防兽医学报》2018,(9)

为获得从江香猪源m RNA脱帽增强因子3 (EDC3)基因编码区序列,并分析其在从江香猪器官组织和淋巴组织中的表达情况,本研究利用套式PCR扩增获得EDC3全基因序列,对其进行测序分析;同时建立荧光定量PCR(qPCR)方法,分析EDC3在组织中的表达情况。结果显示,从江香猪源EDC3基因全长1 404 bp,编码468 aa。不同物种间EDC3基因核苷酸序列和推导氨基酸序列具有较高的保守性,该蛋白中存在丰富的磷酸化位点,空间结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。q PCR结果显示,EDC3基因在从江香猪不同器官组织及淋巴组织中均有分布且有不同程度的表达,在淋巴组织表达量最高,肺脏中表达量最低。综上,本研究首次克隆出猪源EDC3基因,且与预测野猪EDC3基因编码区序列相比缺失123 bp,在第100、473、819、1252位出现了单个碱基置换;其在不同组织中广泛分布。研究结果为进一步探究哺乳动物源EDC3的作用机制奠定基础。  相似文献   

贵州省部分地区规模化猪场仔猪4种致猪腹泻病病毒感染调查     

毛黎红  王开功  周碧君  文明  程振涛  温贵兰  冯旭芳 《动物医学进展》2015,36(5)

为了解贵州省规模化猪场猪病毒性腹泻的流行情况,从5个地区9个规模化猪场采集的腹泻仔猪的粪便和病死猪的肠内容物及肠系膜淋巴结共66份,采用PCR或RT-PCR方法,分别进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的核酸检测。结果显示,PEDV、TGEV、RV和PCV-2检出率分别为72.72%、1.52%、12.12%和3.03%;PEDV/PCV-2、PEDV/RV、PEDV/TGEV混合感染率分别为3.03%、15.2%和1.52%,总混合感染率为19.70%,其中5个猪场为PEDV单独感染。结果表明,贵州省部分地区规模化猪场发生腹泻病的主要病原为PEDV,其次是TGEV、RV和PCR-2,且存在混合感染,为贵州省猪病毒性腹泻的防控提供一定的参考资料。  相似文献   

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

伍祥龙  温贵兰  袁翠霞  周碧君  文明  李永明 《动物医学进展》2008,29(7)

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。  相似文献   

一例猪附红细胞体病的实验室诊断     

张喜懿  温贵兰  张升波  李昌红  徐丽  田浪  杨佰启  陈广  程振涛  王开功  周碧君  文明 《贵州畜牧兽医》2019,43(2):27-30

为确定贵州省长顺县某养殖场猪群突然发病死亡的原因,无菌采集5头发病猪的血液作为检测病料,采用细菌分离培养、病毒核酸检测和血涂片检查3种方法进行实验室诊断。结果:细菌分离培养和病毒核酸检测均为阴性;血涂片姬姆萨染色镜检显示大部分红细胞边缘不整齐,呈星芒状、锯齿状、刺球状等不规则形状,符合附红细胞体感染特征。结论:猪群发病原因为附红细胞体感染。  相似文献   

鸡滑液囊支原体的RT-PCR检测及基因序列分析     

田浪  温贵兰  程振涛  王开功  文明  周碧君  张升波  杨佰启  李昌红  徐丽  张喜懿  陈广 《贵州畜牧兽医》2019,43(1):45-47

为确诊某鸡场肉鸡发病死亡的病因,通过临床症状、病理变化、RT-PCR检测、病原S1基因序列分析进行综合诊断。结果:(1)病鸡表现食欲不振、精神沉郁、跛行及无法站立、关节肿大等症状,剖检发现肿大关节内有大量黏液。(2)鸡滑液囊支原体RT-PCR扩增出现207 bp特异性条带,与预期结果一致。(3)病原S1基因序列分析显示与GenBank公布的鸡滑液囊支原体基因序列同源性均达到99%,构建系统进化树分析显示与GenBank公布的参考株聚为1支。综合诊断为鸡滑液囊支原体感染。  相似文献