重组外源基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建与鉴定     

潘群兴  何孔旺  王永山  温立斌  茅爱华  郭容利 《畜牧兽医学报》2008,39(9)

将猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒（PPV）VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒（rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap）。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 ku的特异性带,表明rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap在HEK-293细胞中成功地表达了PPV∶VP2和PCV2∶Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合PPV∶VP2-PCV2∶Cap蛋白具有与PPV全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合PPV∶VP2-PCV∶Cap蛋白的粗提物,发现可自行装配成许多病毒样粒子[PPV∶VLP（PCV2）]。  相似文献   

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建     

张雪寒  何孔旺  赵攀登  栾晓婷  叶青  温立斌  倪艳秀  周俊明  李彬  王小敏  郭容利  俞正玉  茅爱华  吕立新 《华北农学报》2011,(5):76-82

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌.志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子.选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,...  相似文献   

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较     

周忠涛  王小敏  汪伟  茅爱华  温立斌  倪艳秀  何孔旺 《农业科学与技术》2015,(1)

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。  相似文献   

猪抗病毒蛋白基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

温立斌  何孔旺  杨汉春  倪艳秀  吕立新  张雪寒  茅爱华 《中国农业大学学报》2009,14(2)

根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要的技术。  相似文献   

1株猪流行性腹泻病毒CH/JSNT/2022/Jan株的分离及其S基因遗传进化分析     

周金柱  范宝超  李基棕  茅爱华  王丹丹  郭容利  钟纯燕  李科茫  武琦  张雪寒  李彬 《畜牧与兽医》2023,(3):88-95

2022年1月份江苏南通一养猪场产房仔猪发生严重腹泻，发病率和死亡率均超过80%,原因未知。死亡仔猪肠道样本经RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PoRV),结果显示：仅PEDV检测为阳性，TGEV、PDCoV和PoRV检测均为阴性。将处理好的肠内容物接种Vero细胞，接种后48 h即观察到典型细胞融合、聚集成合胞体的PEDV典型细胞病变，且能够在Vero细胞上稳定传代，表明成功分离到病毒，并将其命名为CH/JSNT/2022/Jan株。通过电镜观察，观察到近似球形、直径约为100 nm、表面有囊膜和纤突的冠状病毒样粒子，表明分离毒株可能为PEDV。进一步对该毒株的S基因进行测序，序列相似性分析结果显示，分离毒株CH/JSNT/2022/Jan与PEDV S基因参考毒株的核苷酸序列相似性为93.5%～99.7%,氨基酸序列相似性为92.8%～99.9%;遗传进化分析结果显示，该分离株为GⅡa型，与多个2020年和2021年中国流行株处于同一进化分支，与疫苗株CV777、AJ1102和LW/L的遗传进化距...  相似文献