出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与stx1／2B融合基因的构建和表达   总被引：4，自引：0，他引：4  

张雪寒  何孔旺  卢维彩  俞正玉  茅爱华  刘亚栋 《内蒙古农业科技》2009,(3):59-61

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157：H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗．其中亚单位疫苗具有很大优势。方法：构建表达tir和stxb的融合基因。将tir基因中间295个氨基酸残基（Tir295）与stxB亚基基因72个氨基酸串联。构建pET28a—stx2b—Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS--PAGE电沫检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果：薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％左右。结论：由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成．可刺激机体产生针时转位紧密素受体（Tir）和志贺毒素（stx）的抗体,在EHEC0157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。  相似文献   

肥育猪伪狂犬病流行新特点及发病原因分析     

孙华伟  张敬峰  赵永前  茅爱华  蒋晨慧 《养猪》2015,(1)

<正>众所周知,伪狂犬病可造成种猪繁殖障碍,哺乳仔猪早期大量死亡,肥育猪生长迟滞,伪狂犬病暴发时,哺乳仔猪的死亡率高达80%。但是肥育猪的伪狂犬病常常被人们忽视,在最近一年的猪病临床诊断和实验室诊断中发现,肥育猪的伪狂犬病并不像多数教科书和期刊上所描述的只表现轻微的呼吸道病症状、病死率低、病程短等,而是发病率和死亡率均较高。现将近期遇到的肥育猪伪狂犬病流行新特点及发病原因分析总结如下。  相似文献   

次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型GN061215生物学特性及蛋白质表达的影响     

周俊明  何孔旺  倪艳秀  张雪寒  杨志彪  祝昊丹  温立斌  俞正玉  茅爱华  吕立新 《江苏农业学报》2013,(1):114-120

为了了解次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)对猪链球菌2型GN061215致病力的影响机制,利用同源重组技术,敲除猪链球菌2型GN061215的impdh基因,重组后的GN061215命名为GN061215(△IMPDH),比较GN061215与GN061215(△IMPDH)培养特性、生化特性、致病力以及基因转录水平差异。结果显示impdh基因敲除后,引起GN061215生长曲线迟缓期延长,降低了GN061215生长曲线平台期OD600峰值,同时截短了GN061215菌株成链长度;GN061215、GN061215(△IMPDH)对46种代谢底物利用能力一致,对2种代谢底物利用存在差异;GN061215(△IMPDH)对Balb/c小鼠的致病力较GN061215菌株有一定程度的下降。SDS-PAGE显示GN061215(△IMPDH)菌体的粗提蛋白质条带较GN061215有显著减少;基因芯片比较GN061215、GN061215(△IMPDH)基因转录差异发现,下调基因中存在36个关联核糖体大、小亚基合成的基因,而在上调基因中不存在该类基因,表明impdh基因的丢失影响了GN061215菌株核糖体大、小亚基的合成,进而显著减少了GN061215菌株菌体蛋白质的表达,这可能与GN061215菌株毒力的下降有关。  相似文献   

猪Hokovirus TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用     

李彬  杜露平  何孔旺  刘浩飞  温立斌  张雪寒  郭容利  茅爱华  倪艳秀 《中国预防兽医学报》2013,35(6)

为建立检测PHoV的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据PHoV的VP2基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有VP2基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果显示,该方法的检测灵敏度为10拷贝;而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3.29％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的225份临床样品进行检测,结果显示,PHoV的阳性率为14.2％.本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可以为PHoV的流行病学调查和发病机制等研究提供可靠的工具.  相似文献   

猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的流行病学调查     

王小敏  何孔旺  张文文  周忠涛  茅爱华  俞正玉  温立斌  倪艳秀  张雪寒  郭容利  吕立新  李彬  周俊明 《华北农学报》2012,(Z1):390-394

研究2009-2010年我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的情况。采用PCR和RT-PCR方法对采集自我国安徽、江苏、山东、浙江等7省的227份组织和血清样品进行PCV2和PRRSV检测。PCV2a感染率为15.9%,PCV2b感染率为44.5%,PRRSV感染率为45.8%,其中17份样品表现为PCV2a和PRRSV的混合感染,50份样品表现为PCV2b和PRRSV的混合感染,10份样品表现为PCV2a,PCV2b和PRRSV的混合感染,分别占样品总数的7.5%,22.0%和4.4%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。  相似文献   

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 toxB基因缺失株的构建     

张雪寒  何孔旺  赵攀登  栾晓婷  叶青  温立斌  倪艳秀  李彬  郭容利  王小敏  周俊明  俞正玉  茅爱华  吕立新 《江苏农业学报》2012,(2):337-343

为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。  相似文献   

正常屠宰猪致病性猪链球菌7型的鉴定和特性研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

茅爱华  倪艳秀  吕立新  俞正玉  周俊明  胡东波  温立斌  张雪寒  郭容利  李彬  王小敏  何孔旺 《江苏农业科学》2011,39(5)

从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌,命名为HA100111.该细菌呈链球菌的特征形态,药敏试验表明该菌株对多种抗生素有耐药性.经PCR及序列分析,确定该分离菌株为猪链球菌7型,其毒力因子基因型为gdh +/mrp -/epf-/sly -/orf2 +/fbps+.动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和新西兰兔有较强的致病性,对ICR小鼠半数致死量为2.67 ×107 CFU,但是对仔猪无明显致病作用.得出结论,在正常猪扁桃体中可携带致病性的猪链球菌7型.  相似文献   

正常屠宰猪致病性猪链球菌9型的鉴定和特性研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

倪艳秀  茅爱华  俞正玉  吕立新  温立斌  张雪寒  郭容利  周俊明  何孔旺 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2009,30(1)

从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌HA070725,呈链球菌的特征形态,β溶血,药敏试验表明该菌对多种抗生素产生耐药性.经PCR及序列分析,为猪链球菌9型.其毒力因子基因型为mrp-/epf-/sly-/orf2+/gdh+/fbps+/impdh+.动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和断奶仔猪有较强的致病性,对ICR小鼠的半数致死量为2.67×106cfu.结果表明:在正常猪扁桃体中可携带高致病性的猪链球菌9型.  相似文献   

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究     

张雪寒  何孔旺  茅爱华  周俊明  俞正玉  温立斌  倪艳秀  郭容利  吕立新 《中国农业科学》2010,43(12)

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。  相似文献   

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与Hly融合基因的构建和表达     

张雪寒  何孔旺  卢维彩  李丽  茅爱华  周萍 《兽医大学学报》2010,(5):647-650

构建表达Tir和Hly的融合基因,将Tir基因的C端414个氨基酸残基（Tir414）基因部分与Hly基因的C端300个氨基酸残基（Hly300）基因部分串联构建pET28a-Tir414-Hly300重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。由于该融合蛋白由Tir和Hly2部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体（Tir）和溶血素（Hly）的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。  相似文献