珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化     

李新生  闫若潜  方勤美  郝惠芳  崔沛  高风山  李云岗  徐守振  夏春 《中国畜牧兽医》2006,33(9):47-50

为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。  相似文献   

基因序列分析鉴定犬冠状病毒分离株   总被引：1，自引：0，他引：1  

胡桂学  柏亚铎  高风山  赵立峰  夏咸柱 《吉林农业大学学报》2003,25(2):198-202,207

采用双脱氧末端终止法测定了克隆于重组质粒YS1pUC、CI1pUC上的2株因内分离病毒CCV YS1、CI1部分纤突蛋白基因序列．以计算机软件推导氨基酸序列．进行核苷酸和氨基酸序列的多重比较。绘制系统进化树。分析重要抗原位点氨基酸残基的变化情况。预测蛋白质疏水性和二级结构。结果表明：重组质粒中含有571bp的外源基因。核苷酸和氨基酸序列与国外发表的K378等5株CCV相应序列的同源性分别为91．7％--99．4％和92．O％--99．4％。而与猪传染性胃肠炎病毒PUR46株和猫传染性腹膜炎病毒1146株的同源性为90．2％和88．O％--90．O％。A抗原的Ab亚住点上的氨基酸残基与备株CCV相同。不同于其他冠状病毒。由此进一步证明。2株国内分离病毒CCV YS1、CI1为犬冠状病毒。  相似文献   

浅谈饲料加工厂成套设备的安装与调试     

刘庆山  张振国  高风山 《饲料工业》1983,(3)

<正> 饲料加工厂成套设备的安装与调试是饲料厂建设过程最后一个重要环节,其质量好坏对能否及早投产并正常运行关系很大。下面仅就我们在年产3000—5000吨级饲料加工厂进行安装调试的经验来谈谈这方面的一些问题。一、安装队伍的组成由于饲料加工业在我国尚属新的工业部门,饲料加工厂设备的安装与调试又有其特殊性,如在安装过程中往往需要进一步完善或调整工艺流程设计,因此用户与设备制造厂签定承包合同,由制造厂提供成套机械设备并负责  相似文献   

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ     

李新生  闫若潜  高风山  方勤美  郝惠芳  李云岗  陈红英  夏春 《畜牧兽医学报》2006,37(10):1047-1052

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHCⅠ）重链（α链）胞外区与轻链（β2m）成熟肽的重组嵌合分子。采用RT—PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列；采用重叠延伸PCR（Splicing overlap extension PCR method，SOE-PCR）把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT—PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因，大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物，以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板，进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段；测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连，阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。  相似文献   

胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化     

李新生    杜向党  陈红英  高风山  李云岗  夏春 《中国畜牧兽医》2007,34(9):53-57 

 从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)₁₅-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。  相似文献   

禽类DNA疫苗研究进展   总被引：2，自引：0，他引：2  

李新生  闫若潜  陈红英  高风山  李云岗  夏春 《动物医学进展》2005,26(7):22-26

新型疫苗的研究对于禽类传染病的防制意义重大。传统疫苗是基于抗原刺激机体产生特异性抗体的原理,它们大多数激发机体的体液免疫,很难启动细胞免疫。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗作为第3代疫苗,具备传统疫苗和其它基因工程苗不可比拟的优点,能够诱导全方位的免疫反应且使用更安全更方便,DNA疫苗是将外源基因与真核质粒重组后直接导入细胞内,使外源基因在宿主细胞内表达合成保护性抗原蛋白。这是模拟病毒自然感染提呈过程,既能产生细胞免疫,又能产生体液免疫。文章对DNA疫苗在禽类应用的可行性和应用研究新进展作了综述。  相似文献   

5类等位基因鸡BF2胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化     

李新生  杜向党  陈红英  高风山  李云岗  夏春 《中国畜牧兽医》2007,34(9):53-57

从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)₁₅-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。  相似文献