牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价     

任杰  林泠  汤德元  曾智勇  王彬  禹光美  郑如雯  吴道义  黄涛 《中国畜牧兽医》2022,49(6):2056-2063

【目的】 研究牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】 采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒,通过Western blotting进行验证,并通过Reed-Muench法测定病毒滴度,通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】 成功扩增到E0、E2基因目的片段,大小分别为681和1 122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×10¹⁰ PFU/mL;Western blotting检测结果显示,Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带（65 ku）;ELISA检测结果表明,通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平;流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋比值均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。【结论】 本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性,能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。  相似文献   

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究     

刘巧玲  黄涛  汤德元  曾智勇  石柯  林泠  任杰 《中国畜牧兽医》2020,47(7):2190-2199

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。  相似文献   

牛呼吸道疾病综合征的主要病原及检测方法概述     

石柯  刘巧玲  张森  林泠  任杰  汤德元  黄涛 《贵州畜牧兽医》2021,45(1)

牛呼吸道疾病综合征是由于多种细菌和病毒感染引起的综合性疾病,在世界范围内给养牛业带来很大的经济损失。感染病毒主要有牛冠状病毒、牛疱疹病毒1型、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒等,细菌主要有溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、昏睡嗜血杆菌等。在临床病例中多为混合感染,病毒和细菌相互作用使得牛呼吸道疾病综合征的诊断和治疗更加困难。为了更好地防治该病,文章就目前国内外关于引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原及检测方法作一概述。  相似文献