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PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%. 相似文献
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产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。 相似文献
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以MM-3基因工程活菌苗口服免疫妊娠73d、83d、103d母猪各4头,口服及肌注免疫妊娠92d母猪各5头,用间接BA-ELISA法检测血清及乳清中IgG、IgA和IgM型抗K_(88ac)及LTB抗体的动态变化.结果表明,无论口服还是肌注免疫母猪,抗K_(88ac)及抗LTB抗体均极显著增高.肌注以IgG增加为主,口服以IgA增加为主.肌注免疫IgG型抗K_(88ac)抗体滴度极显著地高于口服免疫(P<0.01);口服免疫IgA型抗LTB抗体滴度显著高于肌注免疫(P<0.05).口服及肌注免疫乳清中抗K_(88ac)及抗LTB抗体滴度很高,达1:3200～204800,但在1周内即降低,约减少一半(约3～5个滴度),2～3周内各型抗体下降缓慢,维持在对照组周内水平,4周后达最低水平.妊娠不同时期口服免疫,其血清中抗K_(88ac)抗体的动态变化相似,但乳汁中抗体则差异非常明显,妊娠83d和92d免疫组IgG、IgA和IgM均显著增加,且高于103d组(P<0.01)和73d组(P<0.05).口服免疫的最佳时间为分娩前26～30d,肌注免疫最佳免疫时间为分娩前21d. 相似文献
4.
为研究传染性法氏囊病毒(IBDV)保护性抗原VP2与E.coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在戊糖乳杆菌(L.pentosus)中的共表达及其免疫原性,本研究以乳酸杆菌表面表达型和分泌表达型质粒pPG-1和pPG-2为载体,以VP2为目的基因,构建VP2基因单独表达及与LTB基因融合表达的4种重组L.pentosus,分别命名为pPG-1-VP2/L.pentosus、pPG-1-VP2-LTB/L.pentosus、pPG-2-VP2/L.pentosus及pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus。表达的重组蛋白分子量大小分别约为47 ku、55 ku、45 ku及53ku。将构建的重组L.pentosus分别口服免疫SPF雏鸡,以IDEXX试剂盒测定体液免疫应答水平,结果显示,不同表达方式的重组L.pentosus均可以刺激机体产生特异性循环抗体和分泌抗体(sIgA),其中pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus诱导产生的抗体滴度高于其它组。MTT法检测不同表达方式的重组乳酸菌免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖反应,结果显示特异性抗原对免疫雏鸡淋巴细胞的增殖指数显著高于未免疫组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。这些结果表明4种重组菌均能够刺激机体产生局部黏膜免疫和全身系统免疫应答;并且带有黏膜免疫佐剂LTB融合表达试验组高于VP2蛋白单独表达组。 相似文献
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6.
将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。 相似文献
7.
Diqiu LiuXiangqing Wang Junwei GeSongmei Liu Yijing Li 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》2011,34(1):73-81
The major structural protein VP2 of porcine parvovirus (PPV) was used as the model parvovirus antigen, which has been expressed in Lactobacillus casei fusing with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) as mucosal adjuvant. The VP2-LTB DNA fragment was cloned into vector pPG611 or pPG612 to generated inducible surface-displayed and secretion expression systems based on xylose promoter, designated as rLc:pPG611-VP2-LTB (recombinant L. casei) and rLc:pPG612-VP2-LTB, respectively. Expression of the fusion protein was verified by SDS-PAGE, Western blot immunofluorescence and electron microscopy. It was observed that the level of IgG or sIgA from mice orally immunized with VP2-LTB was higher than that from mice received VP2 and negative control, which demonstrated significantly statistically different. Especially, the titer of IgG or sIgA in mice immunized with rLc:pPG612-VP2-LTB is the highest in this study. In summary, LTB as mucosal adjuvant was able to effectively facilitate induction of mucosal and systemic immunity by L. casei-expressing VP2 fusion protein. 相似文献
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从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。 相似文献
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作者对O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1双拷贝T细胞表位（aa 21-40）、B细胞表位（aa 141-160）融合蛋白2020-2020VP1及其与肠毒素大肠杆菌肠毒素融合后蛋白2020-B-2020和2020-B-2020-STI进行了免疫分析。动物试验表明,用2020-2020VP1、2020-B-2020和2020-B-2020-STI 3种融合蛋白分别免疫动物,免疫动物血清中均可产生针对FMDV的抗体。免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明3种融合蛋白都能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应。2020-B-2020和2020-B-2020-STI融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫保护率如下：2020-B-2020 60%/1.5MLD,2020-B-2020-STI 100%/1.5MLD。2020-B-2020-STI免疫血清中具有STI中和抗体,且融合蛋白不具STI毒性。ELISA结果显示,2020-B-2020和2020-B-2020-STI能与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异性结合。结果表明,2020-B-2020-STI具有开发成为口蹄疫及肠毒素大肠杆菌疫苗的应用价值。 相似文献