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1.
《中国畜牧兽医》2017,(5)
为探讨口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素(IFN-α)基因共表达真核质粒进入临床试验的可行性,本试验用PCR方法扩增了口蹄疫病毒P12A3C及部分2B基因(P12X3C)和猪IFN-α基因,克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,经双酶切鉴定后,将重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α转染BHK-21细胞中,观察目的基因的表达,并将重组质粒免疫豚鼠,检测豚鼠的血清抗体水平、中和抗体滴度及T淋巴细胞增殖情况。结果显示,经酶切鉴定及DNA序列分析成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,转染BHK-21细胞后,通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定证实重组质粒能有效表达。ELISA结果显示,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α比重组质粒pBudCE4.1-P12X3C能诱导机体产生更高水平的抗口蹄疫病毒的血清抗体,且中和抗体滴度也高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组。MTT法检测结果表明,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组淋巴细胞增殖可达15%,而重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组则为11%。攻毒后重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组和灭活疫苗组保护率达100%,高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组的80%。本试验成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3CIFN-α,猪IFN-α作为佐剂可有效辅助口蹄疫DNA疫苗提高动物体内的免疫反应。 相似文献
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3.
为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。 相似文献
4.
根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内.含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌.利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC).在Lipofectamine2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC).半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为10~(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础. 相似文献
5.
为检测Asia 1口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)重组病毒免疫原性和安全性,将构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)基因的重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18间隔2周免疫豚鼠3次,进行特异性抗体、中和抗体、淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚类数量、IFN-γ、攻毒保护以及体内分布研究。重组鸡痘病毒可有效刺激豚鼠产生特异性抗体、中和抗体、T淋巴细胞亚类数量、IFN-γ分泌均显著高于对照组;重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的T淋巴细胞亚类数量、T淋巴细胞转化和IFN-γ分泌高于重组病毒rFPV-P1-2A-3C免疫组;2个重组病毒的攻毒保护率分别为4/5、3/5。2个重组病毒在接种最早12h可检测到重组病毒的基因,最晚7d可检测到重组病毒的基因。结果表明重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18具有良好的免疫原性,可以有效抵御病毒的攻击,体内残留时间短,对免疫动物安全,为开发、应用新型FMDV疫苗奠定了基础。 相似文献
6.
通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin~(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin~(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。 相似文献
7.
利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。 相似文献
8.
猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患病,研制有效、安全、廉价的疫苗是当前主要的研究方向之一。本试验通过PCR方法,从含猪囊尾蚴B抗原（AgB）、猪CD58和猪IFN-γ的重组克隆质粒中扩增出AgB、CD58和IFN-γ基因,然后将其克隆到真核表达载体pBudCE4.1中。重组表达质粒鉴定后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光（IFA）或直接免疫荧光试验分别检测AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21中的表达。结果显示,AgB、CD58和IFN-γ在BHK-21细胞中都成功表达,这为研制抗猪囊尾蚴DNA疫苗奠定了坚实基础。 相似文献
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口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 总被引：10，自引：3，他引：7
根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段，经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后，与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHT连接，得到了重组质粒pFB-P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后，将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac，经抗性及蓝白斑筛选，得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体，将其命名为Bacmid-P12X3C3D；提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞，最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。 相似文献
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CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应 总被引：1，自引：0，他引：1
作者应用含CpG基序序列的重组质粒(即CpG DNA)作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果.结果表明:CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍.CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照;与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照(PD50> 4.69).在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗(50、200μg·头份-1)都比高剂量组(500 μg·头份-1)诱导的抗体滴度高,其中50和200μg·头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14～32 d诱导的抗体滴度高达1:1 500,是标准疫苗的4～5倍,而500μg·头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应.研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔. 相似文献
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共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。 相似文献
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为研究脂多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)诱导的抗病毒免疫反应的影响,本研究采用100 TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞（porcine alveolar macrophage,PAM）,感染12 h后用100 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理感染细胞,分别培养12、24、36、48 h后收集细胞及上清,同时设PRRSV组、LPS组和PAM细胞组,用河南农业大学兽医微生物研究室已建立的Real-time qPCR方法对LPS+PRRSV组和PRRSV组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示,LPS+PRRSV组与PRRSV组相比,PRRSV拷贝数12～48 h均较低,IFN-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,TNF-α mRNA转录水平升高,在48 h时转录水平降低。而与LPS组相比,LPS+PRRSV组IFN-α mRNA转录水平在12 h时升高,24、36、48 h均降低。结果表明,PRRSV感染PAM细胞经LPS刺激后,IFN-α、TNF-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。 相似文献
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口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究 总被引：2，自引：0，他引：2
体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。 相似文献
16.
试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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为探索猪α干扰素（poIFN-α）与白介素-18（poIL-18）融合基因的抗病毒效果,本研究通过融合PCR,以质粒pMD18-T/poIFN-α和pMD18-T/poIL-18为模板扩增猪IFNα-IL18（poIFNα-IL18）融合基因。将poIFNα-IL18融合基因插入原核表达载体pET-28b（+）构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化后,用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上进行抗病毒活性测定。结果表明成功构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18;SDS-PAGE可检测到分子质量为37 ku左右的蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上检测到重组蛋白poIFNα-IL18比单一蛋白poIFN-α和poIL-18的抗病毒活性显著,其抗水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV)活性分别为1.03×105、1.28×104及0.11×104 U/mg。 相似文献
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为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因 3D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180 bp的基因片段.将回收的目的片段与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为FMDV的阳性重组质粒.将验证正确的重组质粒10倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量PCR试验,建立FMDV 3D基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度.试验结果显示标准曲线的回归方程为Y=-3.727X+32.04,回归系数R2=0.980,熔解曲线为单一峰.建立的荧光定量PCR方法的灵敏度为1.2×101 拷贝/μL,只与FMDV反应.结果表明,建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测FMDV在动物组织细胞中的含量提供了技术方法. 相似文献
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本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD... 相似文献