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1.
试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。 相似文献
2.
本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。 相似文献
3.
猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。 相似文献
4.
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路. 相似文献
5.
本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus,FPV）,以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点,然后用AgeⅠ和Nhe Ⅰ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4 ℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞（F81）,利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。 相似文献
6.
逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
7.
本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区. 相似文献
8.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
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《中国家禽》2019,(2)
试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。 相似文献
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为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。 相似文献
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To construct a lentiviral vector RCASBP carrying the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene which could be expressed stably in DF-1 cell,EGFP gene was amplified by PCR and then inserted into the lentiviral vector RCASBP after digested with the restriction endonuclease ClaⅠto construct recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP.The recombinant vector was transfected into DF-1 cells by LipofectamineTM 2000.Avian leukosis virus (ALV) p27 antigen ELISA test was performed after four passages of the transfected cells and the positive results of ELISA suggested the success rescue of the virus.The expression of EGFP was observed in more than 80 percentages of DF-1 cells under fluorescence microscope.The proviral genome PCR showed EGFP gene carried by the recombinant lentiviral vector RCASBP-EGFP had been integrated into the genome of DF-1 cells.The RCASBP lentiviral-mediated expression system provided a basis for study of the structure and function of ALV genes. 相似文献
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为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（107.1TCID50/0.1 mL）较原毒株（108.8TCID50/0.1 mL）下降约101.7TCID50/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。 相似文献
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从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。 相似文献
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【目的】 环指蛋白185（ring finger protein 185,RNF185）是Ring家族E3泛素连接酶的一员。试验旨在探明鸡源RNF185对A亚群禽白血病病毒（Avian leukemia virus subgroup A,ALV-A）体外复制的影响,为进一步研究鸡源RNF185对ALV-A致病性的影响和介导的致瘤机制提供参考。【方法】 参考GenBank中已公布的鸡RNF185基因（登录号：NP_001007841）序列分别设计RNF185过表达引物和RNF185单链shRNA,通过PCR扩增RNF185基因及合成双链shRNA,将其分别克隆至真核表达载体psi-flag和干扰载体pLKO.1-GFP,并使用PCR、双酶切和测序等方法验证重组质粒。使用Western blotting验证重组质粒的表达和干扰效果,并使用CCK-8试剂盒检测重组质粒对DF-1细胞活性的影响。在RNF185过表达和干扰后的DF-1细胞中分别接种104半数组织感染剂量（TCID50） ALV-A （rHB2015012）病毒液,于接种完成后3、4和5 d收取细胞,并使用Western blotting检测ALV-A的病毒载量。【结果】 PCR成功扩增出RNF185基因,单链shRNA经退火后形成双链shRNA,并成功构建重组质粒psi-flag-RNF185、pLKO.1-RNF185-1和pLKO.1-RNF185-2。Western blotting结果表明,构建的过表达和干扰质粒能够在DF-1细胞中稳定表达和干扰RNF185。CCK-8结果表明,过表达和干扰RNF185不影响DF-1细胞的活性。RNF185过表达可以促进ALV-A在DF-1细胞中的复制,干扰RNF185表达可以抑制ALV-A在DF-1细胞中的复制。【结论】 本研究构建了可以在DF-1细胞中高效表达和干扰RNF185的过表达质粒和干扰质粒,RNF185对DF-1细胞增殖无明显影响,能够促进ALV-A （rHB2015012）在体外的复制。 相似文献
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研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。 相似文献
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为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研... 相似文献
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【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT... 相似文献
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为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧... 相似文献