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禽流感病毒A／Afri.Star／Eng—Q／983／79／（H7N1）血凝素基因的全？… 总被引：6，自引：0，他引：6
对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的Ｈ７亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）的血凝素（ＨＡ）基因进行了核苷酸序列分析。结果，克隆的ＨＡ基因共１７０７ｂｐ，包括完整的阅读框架；同源性分析表明该毒株起源于欧亚群系；ＨＡ裂解位点只有一个碱性氨基酸，显示典型的低致病力特征。Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因的克隆成功为分子诊断和基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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禽流感RT—PCR诊断法的建立 总被引：34，自引：1，他引：33
根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法,应用此法对鸡胚培养ＡＩＶ尿囊液,ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）,传染性氏囊病病毒（ＩＢＤ 相似文献
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禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性 总被引：22，自引：3，他引：19
禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。 相似文献
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禽流感RT-PCR诊断法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法。应用此法对鸡胚培养的ＡＩＶ尿囊液、ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩散试验和电镜技术作了对比。特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征病毒（ＥＤＳ－７６Ｖ）等的感染鸡胚尿囊液作为对照。结果表明,ＡＩＶ尿囊液ＲＴ－ＰＣＲ全部阳性,ＳＰＦ感染鸡粪便８７份,ＲＴ－ＰＣＲ检出６９份阳性,样品处理浓缩后琼脂扩散检出１１份,电镜检测了２３份样品,仅检出２份阳性。非特异性对照样品经ＲＴ－ＰＣＲ检测全部阴性。将ＡＩＶ感染鸡胚尿囊液作１０倍系列连续稀释,可检出稀释度为１０－２的病毒尿囊液。ＲＴ－ＰＣＲ最早检出时间为感染后第３天,而琼扩和电镜均是７天。该法具有高度的特异性和灵敏性,且节约时间（只需８小时左右）,可从分子水平上对ＡＩＶ进行早期快速诊断和流行病学调查 相似文献
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我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。 相似文献
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禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究 总被引：48，自引：1，他引：47
用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散 相似文献
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猪生殖—呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH—1a株N基因的分子克隆,？… 总被引：3，自引：0，他引：3
根据已发表的ＰＲＲＳＶＩＡＦ－ｅｘｐ９１株的核酸序列，设计了一对特异性引物，用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株的Ｎ基因，经补平和磷酸化后，克隆到ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点上，经电泳分析，酶切和ＰＣＲ鉴定证实后，进行序列测定，序列分析表明ＣＨ－１ａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株（美洲型）Ｎ基因核苷酸同一性为９３．２％，氨基酸同一性高达９６．７％，而与ＬＶ株（欧洲株）核苷酸同一性为６３％，氨基酸同一性仅 相似文献
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采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以自行设计的Ｈ７和Н５亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因特异的两对引物，分别扩增了禽流感病毒Ａ／ＡｆｒｉｃａｎＳｔａｒｌｉｎｇ／９８３／７９（Ｈ７Ｎ１）株和Ｇ株（广东鹅体分离株，Ｈ５Ｎ１）约１．７ｋｂ的ＨＡ全基因ｃＤＮＡ。将所扩增的两个基因ｃＤＮＡ未端经Ｔ４ＤＮＡ聚合酶修饰后分别插入ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒中，得到了两个基因的重组质粒。本研究为国内禽流感病毒分子生物学研究奠定了基础 相似文献
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ABC—Dot—ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
建立了ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的方法,其最佳反应条件是：包被液为０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．６的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（ＣＢＳ）,免疫ＩＢＶ ＩｇＧ的最佳工作浓度为１：８０;抗原的最佳浓度为１：８００;封闭剂选用０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．４含３０ｍＬ／Ｌ白明胶的ＰＢＳ,Ｂ－ＡｇＧ和ＡＢＣ－ＨＥＰ的最佳工作浓度为１：２００。用ＡＢＣ－ＨＥＰ的最佳工作浓度为１：２０ 相似文献
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本试验直接从细胞培养液中提取猪瘟兔化弱毒（ＨＣＬＶ）ＲＮＡ，并根据猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株和Ｂｒｅｓｃｉａ株的核苷酸序列，将ＥＩ基因分两段，设计并合成了４条引物。采用反转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ），成功地扩增出了ＨＣＬＶ保护性囊膜糖蛋白ＥＩ基因。以ｐＧＥＭ－Ｔ和ｐＵＣ１９为载体，将ＥＩ基因的两个片段分别进行克隆并转化到大肠杆菌ＪＭ１０１。经过分析鉴定，证明所扩增的片段为ＨＣＬＶＥＩ基因 相似文献
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禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株. 相似文献
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禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析 总被引：20，自引：4，他引：16
采用RT_PCR技术,以A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)RNA为模板,扩增了1.73kb 的HA 全基因cDNA。将HAcDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1728 个核苷酸片段包含了完整的HA基因的开放阅读框架和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子。核苷酸序列比较分析结果表明:A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)有11 个核苷酸差异,同源率99.4% ;与A/HongKong/156/97(H5N1) 有25 个核苷酸差异,同源率98.6 % ;与A/Chicken/HongKong/258/97 (H5N1) 有30 个核苷酸差异,同源率98.3% ;它们的氨基酸序列同源率依次分别为99 .2 % 、98.6% 和98.1% 。受体结合位点的氨基酸序列完全一致;HA裂解位点氨基酸序列也完全一致,各有5 个碱性氨基酸插入。这说明上述4 个流感病毒分离株可能来自同一个祖先,具有相同的毒力和相似的生物学特性。 相似文献
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2004初从正常鸭群中分离到一株鸭源禽流感病毒，命名为A／Duck／HN／4／2004(H6N2)。经对血凝素基因(HA)序列分析发现HA基因全长为1744bp，共编码566个氨基酸，在裂解位点仅含一个碱性氨基酸-精氨酸(R)，符合LPAIV的标准。将所得基因序列与已发表的同一亚型参考序列分析表明，与H6亚型流感HA基因同源性为89．2％-97．1％，经分子遗传演化分析表明本次分离株与香港分离株A／Duck／Hong Kong／3600／99(H6N2)、A／Duck／Hong Kong／3600／99(H6N2)最近。 相似文献
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试验旨在分析2013年新型重配A（H7N9）流感病毒分子流行病学特点。作者从GenBank数据库下载不同分离宿主的流感毒株NA全基因序列,应用分子生物学软件进行遗传进化分析。结果显示,2013年新型重配A（H7N9）流感毒株NA蛋白颈部氨基酸发生缺失,其唾液酸结合（HB）位点发生一定程度适应性变化,NA蛋白糖基化位点为7个,NA蛋白酶活性中心未发生变异。与A/Hangzhou/1/2013（H7N9）株中NA片段的核苷酸同源性较高的前10个序列均分离自亚洲5个国家的禽类,同源性达96%以上。至于此次新型重配A（H7N9）流感毒株NA基因是否是禽传给人尚不清楚,还有待进一步研究。 相似文献
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为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。 相似文献
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为进一步分析禽流感病毒(AIV)H5N2分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表H5亚型禽流感HA基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR技术,以禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/72420/96(D96)RNA为模板,扩增了HA全基因并进行核苷酸同源性比较,氨基酸编码分析,绘制系统发育进化树。结果表明,扩增片段长1737个核苷酸,包含了完整的HA基因的开放阅读框架,与Genbank已发表的H5N1和H5N2分离株的HA基因序列比较,发现与国内H5N1分离株同源性较低,只有80%左右,而与H5N2各株序列具有很高的同源性,最高达97.5%,印证了AIV基因组8个片段间频繁的重组及AIV高变异性的特点。推导的氨基酸序列分析表明,HA蛋白裂解位点上游丢失了4个连续碱性氨基酸(R-R-R-K),裂解位点处氨基酸序列为E-T-R,仅包含一个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病性毒株的特征,证明为低致病性毒株。其HA推导后氨基酸序列与H5N1AIV的同源性接近90%,以其研究的疫苗,可以有效抵御我国流行的H5亚型AIV病毒的感染,同时因为是弱毒株,以其研制的疫苗具有更好的安全性,也更符合公共卫生学的要求。 相似文献
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以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株 相似文献
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鸭源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及其HA和NA基因的生物信息分析 总被引：1，自引：1，他引：0
分离到1株 H5N1亚型高致病性禽流感病毒, 经序列测定发现HA蛋白裂解位点上插入多个连续的碱性氨基酸（PQREIRRKKR*G）,从分子上证实是一株高致病性禽流感病毒。核酸序列比较分析结果表明,分离的流感病毒HA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.8%;NA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1) 和A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.7%。氨基酸水平上,HA与A/duck/Viet Nam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,可达99.3%;NA与A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达98.7%。HA与NA基因的潜在糖基化位点与作者所选参比毒株一致。通过遗传进化树分析结果表明,A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)可能是该毒株的来源株。 相似文献
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本试验对1株2010年从广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/QY/2010(H9N2)的生物学特性进行研究并对其全基因组序列进行分析。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量 EID50为10－9/0.1 mL,鸡胚最小致死量的平均死亡时间MDT为104 h,脑内致病指数ICPI值为0.51,静脉致病指数IVPI为0。用RT-PCR方法扩增病毒的基因组各片段,将扩增片段进行克隆、测序并进行序列分析。结果显示,该毒株的HA基因与Ck/HK/G9/97和Dk/HK/Y280/97在同一分支上,HA的裂解位点为PARSSR↓GLF,有8个潜在糖基化位点,226位氨基酸残基为L,较保守的202位受体结合位点由L突变为P,该毒株的HA和NA核苷酸序列与Dk/HK/Y280/97同源性较高,NS、PA、PB1的核苷酸序列均与Ck/SH/F/98同源性较高,NP基因与A/VN/ 1203/04(H5N1)的核苷酸序列同源性为95.3%。 相似文献
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Molecular characterization of low pathogenicity H7N3 avian influenza viruses isolated in Italy 总被引：2，自引：0，他引：2
Di Trani L Bedini B Cordioli P Muscillo M Vignolo E Moreno A Tollis M 《Avian diseases》2004,48(2):376-383
The complete coding regions of the surface glycoproteins, nucleoprotein (NP), polymerase 2 (PB2), and matrix (M) of A/turkey/214845/02 and A/turkey/220158/99 (H7N3) low pathogenicity avian influenza (LPAI) viruses isolated in October 2002 in Italy were amplified and sequenced to determine the epidemiologic relationships with an A/turkey/Italy/4603/99 (H7N1/4603/99) LPAI virus isolated during the 1999-2001 epizootic in Italy. The hemagglutinin (HA) of H7N3 viruses showed 97.8% nucleotide similarity with A/turkey/Italy/4603/99 (H7N1), and NP, M, and PB2 gene similarities were 93.6%, 98.2%, and 96.2%, respectively. Phylogenetic analyses of HA, PB2, and M genes showed that H7N3 and H7N1 viruses were closely related. Sequence analysis revealed a 23 amino acid deletion in the stalk of the neuraminidase of H7N3 viruses and a unique deletion of amino acid glycine in position 17 in the NP gene of H7N1 virus. 相似文献