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1.
《中国动物传染病学报》2015,(2)
应用筛选出的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)结构蛋白S1基因的T细胞抗原表位盒、Australia T株和M41株S1基因的B细胞抗原表位,定向克隆入真核表达载体p VAX1,构建成5个真核表达质粒:p VAX-S1T+M、p VAXS1B-M41、p VAX-S1B-T、p VAX-S1T+S1B-M41、p VAX-S1T+S1B-T。将每组提取制备的质粒溶液通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄SPF雏鸡,28日龄时加强免疫1次,同时设立PBS组作为对照免疫组。分别在首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d翅静脉采血并分离血清,用间接ELISA方法检测抗体效价。二免后10 d用IBV病毒液攻毒测定保护率。ELISA抗体效价结果显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,p VAX-S1B-T、p VAX-S1T+S1B-M41和p VAX-S1T+S1B-T组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义(P0.05),p VAX-S1、p VAX-S1T+M和p VAX-S1B-T组与PBS组相比差异具有极显著统计学意义(P0.01)。攻毒结果表明,p VAX-S1、p VAX-S1B-T组的保护效率均为75%,高于PBS组(12.5%),表明表位抗原成分能够有效发挥保护效力,与S1全基因疫苗组保护率相当。本研究结果为研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途径。 相似文献
2.
为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性，试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上，然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组，分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原，检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明：重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达，并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应；首次免疫后第28天，S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(... 相似文献
3.
《中国兽医学报》2015,(4):601-607
利用PCR方法扩增出鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子基因序列,克隆至pcDNA3.1和pCIneo载体中以替代CMV启动子,获得含鸡源启动子的真核表达载体pcDNA-act和pCIneo-act。将IBV ZY3S1蛋白抗原表位基因亚克隆到启动子替换前后的质粒中,然后将重组质粒转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)中,采用间接免疫荧光试验检测转染细胞对S1蛋白抗原表位的表达。将重组质粒以150μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,同时设立IBV灭活疫苗组及PBS空白对照组,经间接ELISA检测免疫前后血清中IBV特异性抗体,最后使用ZY3强毒株给各组实验动物攻毒,观察鸡群的发病死亡情况,计算攻毒保护率。结果显示,替换启动子后的表达载体在CEF中对S1蛋白抗原表位的表达量以及实验动物的抗IBV抗体水平均高于未更换启动子的相应载体,攻毒后鸡群的发病率和死亡率均比替换前降低,说明外源基因的表达和启动子的来源有密切的关系。 相似文献
4.
为探究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白重组乳酸菌对小鼠免疫应答情况,本研究将IBV CH/LN/2019毒株的S1基因进行密码子优化,构建重组质粒pNZ8149-S1,电转至乳酸乳球菌NZ3900中,应用Western blot及间接免疫荧光试验评价重组乳酸乳球菌表达水平,免疫SPF小鼠,通过间接ELISA方法分析小鼠特异性抗体、CD4+、CD8+和细胞因子(IL-4和IFN-γ)分泌情况;结果显示,成功构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900并表达目的蛋白;小鼠免疫试验结果显示,免疫组小鼠IgG抗体水平均高于pNZ8149/NZ3900、NZ3900和PBS组(P<0.05);特异性sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);此外,重组乳酸乳球菌能诱导小鼠产生较高水平的IL-4和IFN-γ(P<0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900可以有效刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫,为IBV新型口服疫苗的研制提供了理论参考。 相似文献
5.
流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。 相似文献
6.
为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。 相似文献
7.
膜蛋白是禽传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白,可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇,能诱导细胞介导的免疫反应,但其免疫生物学功能尚不清楚.本研究选择禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBWJ,通过RT-PCR扩增获得其膜蛋白基因M基因并插入到PGEM-T载体中,获得重组质粒PGEM-M,将重组质粒中的克隆片段进行序列测定及分析.对PGEM-M进行双酶切获得M基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过菌落PCR、双酶切证明获得了M基因的真核表达质粒.利用DNAstar软件将IBV SAIBwj株的膜蛋白基因的核苷酸序列与GenBank中的国内外参考毒株进行比较,其核苷酸序列的同源率为91.6%～98.8%,氨基酸序列的同源率为91.6%～99.6%.糖基化位点的增加和减少对M蛋白的抗原性产生很大的影响.在M蛋白近N端含有两个糖基化位点,第一个跨膜疏水区距离亲水区大约20个氨基酸.SAIBwjM基因核苷酸、氨基酸进化关系可以看出,SAIBwjM与国内外参考株的同源性均较高,因此可能具有交叉保护性抗原,可望用于制备诊断试剂及制备基因工程疫苗.由于IBV变异较大,常规疫苗不能产生完全保护力.在IBV的免疫保护机制中,细胞免疫起着关键的作用,近年来一些研究者已经进行了IBVDNA疫苗的研究,并取得了一定的进展.IBV的S1基因真核表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应,由于S1基因经骨骼肌细胞内源性表达后主要通过MHCI类分子提呈抗原,特别有利于CD8+细胞毒T淋巴细胞的激活,对IBV免疫保护极有意义.陈洪岩等将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒,经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高,至35日龄左右达到高峰,但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗.质粒DNA免疫攻毒后有40%的鸡可耐过强毒的攻击,说明S1基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力.刘思国等将鸡传染性支气管炎HB株的核蛋白基因(N基)亚克隆到pcDNA3,构建了真核表达质粒pcDNA-N.用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验,结果保护率为40%,表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用.现在的DNA疫苗研究主要集中在免疫原性较高的N基因和S基因,对免疫原性较低的M基因的研究,国内未见报道.国外有报道M蛋白也能刺激机体产生低水平的抗体,M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇,本研究将为进一步研究M基因的免疫原性及其在IBV中的作用基础材料. 相似文献
8.
鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过文献报道和计算机软件分析筛选出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)结构蛋白基因S1、S2、N基因的T、B细胞的优势抗原表位共7段,采用人工合成及PCR方法将各抗原表位以柔性氨基酸(GP/GA)作为接头串联成一条全新的多表位嵌合基因F,并定向克隆入真核表达质粒pVAX1,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒.阳性质粒pVAX-F通过脂质体转染COS-7细胞进行表达研究.提取转染细胞总RNA,RT-PCR方法检测到目的基因的转录;间接免疫荧光试验(IFA)检测到特异性荧光存在.表明表达产物能与相应抗体特异性结合,证明了具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗IBV的核酸疫苗. 相似文献
9.
根据GenBank中发表的猪的IgG Fc段基因及鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计并合成引物.以猪肝组织总RNA为模板扩增出猪IgG Fc基因,以舍全长IBV M41 S基因的质粒为模板扩增出IBV S1基因,分别克隆至T裁体.DNA测序表明,所获得的IBV S1基因大小为1.5 kb,lgG Fc大小为1 kb,序列正确.将IBVS1与IgG Fc基因串连,插入舍有人组织型纤维蛋白溶酶原激活物分泌信号肽序列(tPA)的真核表达载体pcDNA3.1-tPA上,在HeLa细胞上进行瞬时融合表迭.经免疫光和斑点杂交检测,表达产物同时具有IBV S1蛋白和IgG Fe活性. 相似文献
10.
试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG1和IgG2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4+和CD8+含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG1和IgG2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4+和CD8+含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。 相似文献
11.
传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的真核表达及免疫原性检测 总被引：4，自引：0，他引：4
为了探讨S1基因在DNA免疫防制传染性支气管炎(IB)中的免疫原性，将IBV Z株S1基因插入到真核表达栽体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中，构建了真核表达质粒pcDNAIBVZS。在脂质体作用下将pcDNAIBVZS转染CEF细胞，用间接免疫荧光试验检测，在CEF细胞中可见有大量S1蛋白表达。将重组质粒以100μg／只的剂量肌注免疫SPF雏鸡，经问接ELISA试验检测二免前后的血清，结果显示，pcDNAIBVZS基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生，具有特定的免疫原性。 相似文献
12.
为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。 相似文献
13.
为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。 相似文献
14.
《畜牧兽医学报》2016,(3)
利用生物结构技术预测传染性支气管炎S1蛋白的1条细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,并合成相应的候选多肽(Sp6)。为了确定S1蛋白中确实存在该T细胞表位,并鉴定这条T细胞表位的正确性,构建了含有S1基因的重组质粒pCAGGS-S1,通过间接免疫荧光和Western blot确定该重组质粒可以在真核细胞表达后,将该重组质粒免疫SPF鸡,间接ELISA检测血清中的抗体。采集免疫鸡的脾淋巴细胞并用合成的候选多肽刺激,通过实时荧光定量PCR检测脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌量以及流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞的增殖情况,初步确定该候选肽的正确性。间接免疫荧光、Western blot和间接ELISA试验结果表明,S1蛋白能够在293T细胞中获得表达并能够引起机体的体液免疫,说明S1蛋白具有反应原性,为进一步验证T细胞表位打下了基础;荧光定量PCR结果显示Sp6刺激后的鸡的脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加;流式细胞检测发现经Sp6和不相关多肽NP89-97刺激后及空白对照,CD8+T淋巴细胞增殖分别为34.8%、2.6%、0。以上结果表明,多肽Sp6能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,是IBV S1的CTL表位。该研究结果对传染性支气管炎病毒免疫机制和通用疫苗研究具有借鉴意义。此次研究结果表明多肽Sp6能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生CTL,是IBV S1的CTL表位。该研究结果对传染性支气管炎病毒免疫机制和通用疫苗研究具有借鉴意义。 相似文献
15.
应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础． 相似文献
16.
旨在对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）H120株S1蛋白的B细胞及T细胞可能的表位进行预测并合成相应的多肽,然后免疫小鼠,并分析其免疫效果,以验证候选表位多肽的免疫原性。利用表位预测软件筛选并化学合成针对IBV H120株S1蛋白的5条表位多肽,然后免疫小鼠,通过间接ELISA、中和试验和流式细胞技术检测各表位多肽诱导的特异性抗体、中和抗体和外周血T细胞亚群。ELISA检测结果显示,5条表位多肽均具有良好的反应原性,免疫小鼠的血清效价高低顺序依次为Pep76-106 > Pep240-257 > Pep511-537 > Pep403-421 > Pep135-172;中和试验结果表明,5条多肽免疫小鼠的血清中和滴度均高于空白对照组,其高低顺序依次为Pep240-257=Pep403-421=Pep511-537>Pep76-106=Pep135-172;流式检测结果表明,5条多肽免疫小鼠在CD3+、CD4+CD8-、CD8+CD4- T淋巴细胞水平上均极显著高于空白对照组（P<0.01）,CD3+T及CD4+CD8-T淋巴细胞数大小顺序依次为Pep403-421 > Pep240-257 > Pep76-106 > Pep511-537 > Pep135-172,CD8+CD4-T淋巴细胞数大小顺序依次为Pep403-421 > Pep76-106 > Pep511-537 > Pep240-257 > Pep135-172。合成的5条表位多肽中,Pep240-257、Pep76-106和Pep403-421可以诱导体液免疫,Pep403-421可以诱导细胞免疫,其中,Pep403-421可以同时诱导细胞免疫及体液免疫。本研究结果为深入了解S1蛋白的免疫学特性以及研发诊断试剂和有效表位疫苗奠定了基础。 相似文献
17.
为了比较传染性支气管炎病毒3种主要结构蛋白免疫鸡后对CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的不同影响.本试验以pVAX1载体为携带工具,制备分别含有IBV主要结构蛋白基因的质粒免疫健康雏鸡,采用流式细胞仪(FACS)对免疫鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测.结果显示:各试验组间,携带N蛋白基因的质粒在免疫后3周内CD4+T淋巴细胞数和CD8+T淋巴细胞数均高于其他组,且差异极显著(P＜0.01).由此可见,IBV的N蛋白可明显诱导CD8+T淋巴细胞的CTL免疫作用和CD4+T淋巴细胞的辅助性免疫作用,其细胞免疫原性高于S1蛋白和M蛋白. 相似文献
18.
运用生物信息学技术推测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)变异株(793/B)M基因的抗原位点,应用DNAStar软件针对M基因及其抗原表位片段设计3对引物,PCR扩增并成功构建了M基因的pGEX6p-M和2种截短M基因的pGEX6p-M1,pGEX6p-M2原核表达质粒,SDS-PAGE检测分别在50000,32000,29000处有特异性表达条带,表明GST-M,GST-M1,GST-M2重组蛋白获得成功表达;Westernblotting检测显示,GST-M和GST-M1重组蛋白能被鼠抗IBV(793/B)血清识别,而GST-M2重组蛋白不能被识别。GST-M与GST-M1重组蛋白具有良好的抗原性,初步证实M蛋白存在抗原表位,这为进一步研究IBV(793/B)M蛋白的免疫原性和制备基因工程疫苗提供了重要依据。 相似文献
19.
20.
将轮状病毒pW425et-Vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。 相似文献