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1.
共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察 总被引：4，自引：0，他引：4
为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因工程疫苗，以伪狂犬病毒（PRV）gE基因缺失标志疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为病毒载体，通过同源重组，构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22（BHV-1 VP22）融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确，并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB／c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应，并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-／gE^-／E^＋与TK^-／gE^-／E^＋／M^＋进行比较。结果显示TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应，BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
2.
PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
3.
猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。 相似文献
4.
修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫 总被引：6，自引：0，他引：6
为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上，进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCl-52M。间接免疫荧光证实体外表达后，免疫BALB／c小鼠，检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体，并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCl-52进行比较。结果表明，修饰后的DNA疫苗pCl-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCl-52，是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。 相似文献
5.
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株.PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5.将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5).鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测.结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体.本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础. 相似文献
6.
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伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究 总被引：4，自引：3，他引：4
对PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明，该基因缺失疫苗10^5.0TCID50和10^6.0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的，并可保护妊娠母猪抵抗10^7.1 TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后，gE鉴刖ELISA试验表明，PrV Ea TK^-/gE^-/gI^-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以10^5.0 TCID50和10^6.0 TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物，结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象，说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。 相似文献
8.
将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒（CS-FV）E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFVE2、PRRSVGP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5。经Western blot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较，无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。 相似文献
9.
为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSVHB-3株GP5、M和N基因,通过I,inker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因-起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-MN免疫Balb／c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1：4）,随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高（1：32）。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
10.
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。 相似文献
11.
《畜牧与兽医》2014,(11):60-64
为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。 相似文献
12.
本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组GP5蛋白的免疫原性,将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内,转染MDCK细胞,获得了重组病毒,免疫新生仔猪,分别在免疫后0～12周采集血清,通过ELISA检测证明,猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSVGP5的抗体.说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力. 相似文献
13.
本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
14.
为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株，本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物，BamHⅠ引入到引物的5′端，从HP-PRRSV毒株的RNA中，用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接，构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-的ST细胞中，经病毒空斑纯化，获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞，经4轮病毒空斑纯化，最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序，证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基... 相似文献
15.
为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响，应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western blotting检测证明，该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠，前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体，但是此抗体没有中和活性；后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明，中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系，如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。 相似文献
16.
为获得FMDV的衣壳蛋白前体P1和P1与3C基因的重组伪狂犬病毒,并评价两重组病毒的免疫效果,进行了本项研究。将构建的重组转移质粒pIESZP1和pUTK3CP1,用脂质体转染预先感染0.1 MOI PRV的Vero细胞,经120 h培养收获病毒后,再分别用蓝斑筛选和BrdU加压筛选重组病毒3~5次。经过挑斑纯化、扩增培养后用PCR、IFA检测筛选表达的FMDVP1蛋白。用这2株病毒分别免疫BALB/c小鼠,通过SN和ELISA方法检测免疫小鼠的抗体水平。成功地获得了2株可以正确表达目的蛋白的重组伪狂犬病毒rPRVP1和rPRV3CP1。2株重组病毒均可诱导小鼠产生特异性抗FMDV抗体,两重组病毒各项免疫指标之间没有明显的差异。 相似文献
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表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒（pCI—GP5和pcDNA—U—GP5）分别肌肉注射免疫BALB／c小鼠，共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平，MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力，LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性，并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现，2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周，pCI—GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA—U—GP5质粒免疫组；而pcDNA—U—GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4%-CD8^＋T细胞比例明显高于pCI—GP5组。表明，GP5基因可诱导产生较高的免疫反应，泛素与GP5的融合表达可增强PRRSVGP5诱导的细胞免疫反应。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计,构建了GP5/M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的GP5/M融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,免疫家兔,对获得的兔抗GP5/M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示,成功构建10个GP5/M表达载体,10个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-GP5/M重组蛋白质;通过免疫家兔,检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明,试验成功建立了稳定获得GP5/M重组蛋白质的方法,初步鉴定了重组蛋白的免疫效力,为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。 相似文献
20.
以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区. 相似文献