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1.
[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。 相似文献
2.
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
3.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(1)
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
4.
兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。 相似文献
5.
[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PAGE、Western-blot、蛋白含量测定及146S测定等方法对浓缩纯化方法的可行性进行鉴定,并通过动物免疫试验初步验证浓缩纯化后抗原的免疫原性。[结果]VPA融合蛋白能够在大肠杆菌中部分可溶性表达。作为接头蛋白,VPA既能与GEM颗粒结合,又能与FMDV抗原结合。SDS-PAGE与Western-blot结果表明:FMDV通过GEM法得到有效纯化;146S测定结果表明FMDV的回收效率达到99%;总蛋白含量测定结果显示口蹄疫抗原杂蛋白去除率达到90%;动物免疫试验结果显示GEM技术纯化后的FMDV具有良好的免疫原性。[结论]利用GEM技术浓缩纯化口蹄疫病毒抗原是可行的。 相似文献
6.
[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原. 相似文献
7.
《陕西农业科学》2016,(8)
[目的]高效制备金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)用于SEA快速检测相关产品的研究。[方法]通过原核表达的方法表达SEA,对其纯化方法进行研究,通过Western-blot和制备的SEA顺磁微粒免疫层析快速检测试纸条检测其免疫原性。[结果]SEA成功克隆入原核表达载体p ET22b(+),并在E.coil BL21(DE3)中得到有效表达,表达量达63.8%;采用低温诱导可获得可溶性的SEA,其表达量占总SEA的56.3%;可溶性SEA经Ni柱亲和层析一步纯化可得到纯度在95%左右的SEA,Western-blot检测显示所纯化的重组SEA具有SEA的免疫原性。[结论]研究构建的SEA表达载体能够高效、经济、简单的制备SEA,纯化的SEA可用于食物中毒中SEA快速检测相关产品的开发,具有一定的应用价值。 相似文献
8.
为了筛选和鉴定猪链球菌3个保护性抗原GAPDH、MRP、DLDH的优势B细胞抗原表位,设计表位串联方案,研究重组串联表位蛋白(简称GMD蛋白)免疫小鼠后对猪链球菌攻击的免疫保护效力。采用生物信息学分析工具对优势B细胞抗原表位进行筛选,并将表位串联并构建重组质粒pET28a-GMD,诱导表达且纯化后将GMD蛋白配合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,并评价该蛋白对2型猪链球菌的免疫保护效力。发现经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白大小为43.3 kDa;小鼠免疫保护实验结果显示,免疫小鼠血清中针对猪链球菌HA9801菌株抗体效价最高可达1∶102 400,GMD蛋白对小鼠的免疫保护率可达90%。上述结果表明面对猪链球菌HA9801菌株的攻击,GMD蛋白可以为机体提供良好的免疫保护,本研究结果为猪链球菌新型表位亚单位疫苗的研制提供了基础数据。 相似文献
9.
合成含有鸡法氏囊病毒抗原表位核酸序列的4条引物,利用SOE-PCR (重叠延伸PCR法)方法克隆得到含鸡法氏囊病毒多抗原表位串联肽的核酸序列。通过EcoR I和Sal I 两个酶切位点使该核酸序列插入原核表达载体(pET32a)。SDS-PAGE 实验结果表明鸡法氏囊病毒重组多抗原表位串联肽在大肠杆菌中的表达量为20%左右。Western blotting试验和免疫琼脂扩散沉淀试验（AGP）的结果均表明鸡法氏囊病毒重组多抗原表位串联肽具有明显的抗原性。 相似文献
10.
《大连海洋大学学报》2020,(4)
为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。 相似文献
11.
[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap. 相似文献
12.
为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。 相似文献
13.
应用RT-PCR方法从PEDV流行毒株中扩增COE基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建pET-32a-COE重组质粒。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,该重组蛋白获得了表达,主要以包涵体形式存在,分子量约为35.5 ku;Western-blot分析结果显示,所表达的重组蛋白能与抗PEDV小鼠血清反应。应用纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂免疫6周龄BALB/C小鼠并采集血清,ELISA检测抗体效价达1∶3 200以上,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
14.
[目的]构建口蹄疫DNA疫苗[方法]构建以PRV为载体的表达FMDV P1基因的质粒pIESZP1和pUTK3CP1,免疫小鼠并检测了免疫后小鼠的抗体水平.将构建的2个真核表达质粒分别转染Vero细胞,通过PCR、IFA、Western-blot等方法检测目的基因的转录和表达.将正确表达目的基因的DNA质粒肌肉接种3周龄的Balb/C小鼠,采用ELISA和SN方法检测了免疫小鼠体内的抗体水平.[结果]携带有FMDV衣壳蛋白P1基因的DNA质粒能引起小鼠产生特异性的体液免疫反应,两重组质粒诱导小鼠产生抗FMDV的抗体水平无差异.[结论]该研究为含有FMDV P1基因重组PRV以及重组病毒的动物免疫试验以评价基因工程疫苗的免疫效果奠定了基础. 相似文献
15.
《吉林农业大学学报》2014,(1)
为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。 相似文献
16.
[目的]探索主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(Major Histocompatibility Complex,MHCⅠ)提高抗原呈递效率的方法,获得具有免疫学活性的抗原肽-MHCⅠ分子单链三聚体。[方法]采用基因重组技术,通过连接肽(G4S)3将鸡新城疫病毒抗原表位短肽HN(aa346-353)与鸡MHCⅠ(B-F)分子二聚体的编码基因共价串联,构建带有绿色荧光标签蛋白的真核表达载体p EGFP-HN_(346-353)-B-Fβ2m-α。[结果]转染真核细胞293T后,荧光显微镜观察可见,重组融合蛋白HN_(346-353)-B-Fβ2m-α分子三聚体主要表达定位于真核细胞的内膜系统。Western Blot结果表明,在预期蛋白分子量大小位置有明显的特异反应带,重组蛋白与其相应抗体可发生特异性结合反应。[结论]重组质粒能够在真核细胞中表达,且融合蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
17.
为探究大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅰ(Heat-stable toxin typeⅠ,STa)和鸡卵清蛋白(Chicken ovalbumin)串联表达的3×STa-ovalbumin重组融合蛋白的免疫原性,原核表达融合蛋白后,经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定,将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,利用ELISA方法测定免疫小鼠血清中抗STa抗体的滴度,应用体外中和试验检测抗体对STa毒素的中和作用。SDSPAGE检测结果显示,融合蛋白分子质量约42 ku;Western blot分析结果显示,融合蛋白可被STa阳性血清特异性识别。小鼠免疫试验结果表明,融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗STa抗体滴度达到2.33,并且产生的抗体能在体外中和STa的毒性作用。以上结果表明,3×STaovalbumin融合蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
18.
猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。 相似文献
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[目的]制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)多克隆抗体,为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础.[方法]采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck,然后转入大肠杆菌B21(DH3)中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价.[结果]尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值(GRAVY)为-0.454,属于亲水性蛋白,具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,无典型的跨膜区.经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD,主要以包涵体形式存在.免疫日本大耳白兔后可获得效价为1:256000的Lck多克隆抗体,且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白.经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上,纯度约95%,抗体纯化效果良好.[结论]经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性,可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究. 相似文献
20.
[目的]确定丹毒丝菌新疆分离株C43150表面保护性抗原A(SpaA)中起免疫保护作用的主要区段.[方法]PCR扩增SpaA氨基端(spaA-N)和羧基端(spaA-C)基因片段,测序鉴定正确后,克隆至pGEX4T-1原核表达载体,以IPTG诱导表达重组蛋白r-SpaA-N及r-SpaA-C,表达产物经亲和层析柱纯化后,免疫小鼠制备抗血清,Western Blot及ELISA检测重组蛋白的免疫反应性,最后分别从主动和被动免疫两方面分析r-SpaA-N及r-SpaA-C对小鼠的免疫保护活性.[结果] Western Blot结果表明抗r-SpaA-N及r-SpaA-C小鼠血清均能与天然的SpaA在64 kDa处特异性结合,ELISA检测也表明重组表达和纯化的融合蛋白都具有免疫原性,但小鼠免疫保护实验显示只有r-SpaA-N对攻毒小鼠保护作用显著(P<0.01).[结论]丹毒丝菌新疆分离株C43150表面保护性蛋白A起主要保护功能的核心区段为氨基端,且是由抗体介导的免疫保护. 相似文献