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1.
为检测Asia 1口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)重组病毒免疫原性和安全性,将构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18(Interleukin 18,IL-18)基因的重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18间隔2周免疫豚鼠3次,进行特异性抗体、中和抗体、淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚类数量、IFN-γ、攻毒保护以及体内分布研究。重组鸡痘病毒可有效刺激豚鼠产生特异性抗体、中和抗体、T淋巴细胞亚类数量、IFN-γ分泌均显著高于对照组;重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的T淋巴细胞亚类数量、T淋巴细胞转化和IFN-γ分泌高于重组病毒rFPV-P1-2A-3C免疫组;2个重组病毒的攻毒保护率分别为4/5、3/5。2个重组病毒在接种最早12h可检测到重组病毒的基因,最晚7d可检测到重组病毒的基因。结果表明重组鸡痘病毒rFPV-P1-2A-3C和rFPV-3C-P1-2A-IL-18具有良好的免疫原性,可以有效抵御病毒的攻击,体内残留时间短,对免疫动物安全,为开发、应用新型FMDV疫苗奠定了基础。 相似文献
2.
以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
3.
为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。 相似文献
4.
利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。 相似文献
5.
将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。 相似文献
6.
共表达新城疫病毒F基因、传染性法氏囊病病毒VP0基因的重组鸡痘病毒的抗原性和免疫原性 总被引：11，自引：2，他引：9
以鸡痘病毒(FPV)282E4株TK基因为侧翼,将2个相同的复合启动子ATI@p7.5×20以反向方式连接,分别调控新城疫病毒(NDV)F基因和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP0基因,得到重组转移质粒pVP0-2ATI@p7.5×20F.然后将该重组转移质粒用脂质体转染预先感染FPV 282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF),在经BrdU(5-溴-脱氧尿嘧啶)加压处理后的CEF上传代,用间接免疫荧光试验、Western blot检测,有2株鸡痘病毒能同时表达NDV F蛋白和IBDV VP0蛋白.用这2株重组鸡痘病毒刺种商品Leghorn雏鸡,于刺种前及刺种后1、2、3周对抗NDV特异性抗体水平和淋巴细胞转化能力检测,结果发现,重组鸡痘病毒能激发机体产生良好的免疫反应.结果表明,重组鸡痘病毒可以作为疫苗备选株进行研究与开发. 相似文献
7.
禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因与鸡IL-18基因真核共表达载体的构建及表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA3的序列，设计1对特异性引物，以重组质粒pcDNA3／IL-18为模板，扩增出具有完整真核表达结构的CMV-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA3／ompH中，经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成功构建了共表达禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因和鸡IL-18基因的重组表达质粒。将共表达质粒转染Cos7细胞，经RT—PCR、SDS—PAGE及Western blotting检测，证明了外膜蛋白H基因及鸡IL-18基因均获得了瞬时表达，为研究禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H的免疫原性和鸡IL-18在基因疫苗中的免疫调节作用奠定了基础。 相似文献
8.
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
9.
利用BrdU在CEF(TK~ )细胞中筛选TK~-重组鸡痘病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK )细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的 TK-重组鸡痘病毒 相似文献
10.
根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。 相似文献
11.
设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBacTM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。 相似文献
12.
为研制口蹄疫病毒(FMDV)的新型重组腺病毒疫苗,本研究通过RT-PCR扩增FMDV GD株3C、P1、P1-2A、L-P1和L-2A基因,分别构建重组腺病毒穿梭质粒,并在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183E.coli中同源重组获得腺病毒重组质粒pAd-3C、pAd-P1、pAd-P1-2A、pAd-L-P1、pAd-L-2A,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得含有目的基因的重组腺病毒。将具有感染能力的复制缺陷型重组腺病毒rAd-3C分别与rAd-P1、rAd-P1-2A、rAd-L-P1、rAd-L-2A共感染Vero细胞,裂解细胞收集细胞上清液并进行小鼠免疫试验。经ELISA检测表明,重组腺病毒rAd-3C分别与rAd-P1-2A、rAd-L-2A共感染Vero细胞上清液能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。 相似文献
13.
为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础 相似文献
14.
为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。 相似文献
15.
O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 相似文献
16.
猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。 相似文献
17.
将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护. 相似文献
18.
表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
19.
将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。 相似文献