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1.
为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白.为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15.将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定.将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72 h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL.将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%.Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达. 相似文献
2.
《黑龙江畜牧兽医》2010,(7)
为了研究β-防御素-7基因在大肠杆菌中的原核表达,试验以pGEM-T-GAL-7为模板,经PCR扩增GAL-7基因的编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化E.coliDH5α并在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,并对目的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定。结果表明:重组质粒pGEX-4T-1-GAL-7经PCR及酶切测序鉴定,证明质粒构建正确;重组质粒经诱导表达后,可表达出分子质量约为33ku的GAL-7蛋白;表达产物以融合蛋白形式存在,在37℃条件下诱导4h表达量最高,最佳的诱导浓度为0.1mmol/L。 相似文献
3.
为探明白刺(Nitraria tangutorum)14-3-3基因家族的基本特征及其进化关系,本研究基于白刺转录组数据,利用生物信息学方法,对白刺14-3-3基因家族成员进行鉴定,预测其理化性质、亚细胞定位、保守结构域,分析其系统进化关系及其基因在不同浓度盐、干旱处理下的组织器官表达模式。结果表明：从白刺转录组数据中初步筛选出10个14-3-3家族成员,其中具有完整蛋白质编码区(Coding Sequence,CDS)的9个成员,其蛋白的编码氨基酸的数目为212~297个,等电点在4.73~6.14之间,分子量范围是24.06~33.51 kDa,二级结构主要以α螺旋为主,三级结构高度保守;亚细胞定位预测显示该家族成员主要分布在细胞质上;表达模式分析表明,14-3-3基因在白刺不同组织器官中呈现不同的表达规律,且参与应答外界的干旱和盐胁迫。由此推测,14-3-3基因家族可能在白刺的胁迫防御方面发挥重要功能。本研究结果为进一步深入揭示白刺14-3-3基因家族的功能奠定基础。 相似文献
4.
干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪 IFN-δ基因,片段大小为513 bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。 相似文献
5.
采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含IL-15基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下IL-15基因的表达情况,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET28c（＋）-IL-15含有IL-15基因且阅读框架正确,以IPTG诱导IL-15基因表达的优化条件是：培养基pH7．0,培养温度37℃,IPTG浓度1．0mmol／L,茵体生长密度0D600达到1．0时加入IPTG,诱导时间3h,IL-15蛋白表达量为28％,为IL-15的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
6.
采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。 相似文献
7.
鸡β-防御素-3的克隆与诱导表达 总被引：7，自引：1，他引：7
利用反转录PCR（RT—PCR）与套式PCR技术检测Gal-3基因在鸡体不同组织的分布表达。实验结果表明Gal-3基因在法氏囊、皮肤、舌头、肺脏、骨髓、气管等组织中广泛分布，在肾脏、脾脏、肝脏、胰脏等组织中没有检测到。对从鸡骨髓中扩增出来的β-防御素（Gal-3）cDNA进行克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为297bp，与GenBank中的Gal-3cDNA序列完全相同。核苷酸序列比较表明在同源性上，Gal-3与Gal-1、Gal-2基因核苷酸相似性分别为75％、50％，同火鸡GPV-1基因同源性最高，达9l％。体外诱导表达实验表明在气管上皮细胞中LPS与灭活卡介苗可以诱导Gal-3的表达；Gal-3在法氏囊细胞、肺上皮细胞的表达为持续性表达。 相似文献
8.
干扰素(Interferon,IFN)是活细胞在病毒或其他干扰素诱生剂作用下产生的一种糖蛋白,当它进入未感染的细胞时,可诱导该细胞产生抗病毒蛋白质,从而抑制其他病毒在该细胞中的复制[1]。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能作用。无论哺乳类还是禽类,干扰素都有两大类型,即型(主要是α和β)和型(γ)干扰素。其中α干扰素(IFN-α)由白细胞产生。I型干扰素的抗病毒作用最强,主要是通过旁分泌发挥作用[2]。鸭I型干扰素基因是在1995年由Schults等成功克隆的[3,4]。他们使用已克隆的鸡型干扰素基因1(ChIFN1)作为探针,基因组DNA Southern杂… 相似文献
9.
根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。 相似文献
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重组人γ-干扰素表达菌株的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确.经Western blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的52%.同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hlFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据. 相似文献
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利用RT-PCR技术,从ConA活化的猪外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ) cDNA,克隆到pMD18-T载体中进行测序后,与原核表达载体pET32a(+)重组,表达含His×6的IFN-γ重组蛋白;测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,核苷酸同源性在98.6%~100.0%之间,氨基酸同源性在96.4%~99.4%;经SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量约为27 ku,主要存在于包涵体中,且具有良好的免疫学活性,为进行γ-干扰素深入的研究奠定了基础。 相似文献
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应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致。将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac中,构建了转移载体pFastBac-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ。重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL。表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5d达到高峰。 相似文献
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克隆林麝（Moschus．berezovskii）白介素-2（interleukin．2，IL-2）到酵母表达载体pPIC9K，SalⅠ酶切后转化毕赤酵母GS115，G418抗性筛选高拷贝克隆，再由酵母菌落PCR鉴定；阳性克隆用甲醇诱导表达，SDS-PAGE分析．结果在诱导至第6d的酵母上清浓缩液中，检测到与预测林麝IL-2分子量相接近的，分子量约为18Ku的诱导表达带；TRIzol提取表达期间的酵母总RNA，并通过RT-PCR扩增IL-2 mRNA，发现表达期的重组酵母细胞中存在IL-2 mRNA，而对照没有检出，表明林麝IL-2存在低水平的表达。 相似文献
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MicroRNAs（miRNAs）是一类重要的调节基因转录的非编码小RNA。其中miR-1、miR-133、miR-206是肌肉特异表达的microRNA,同属miR-1家族。它们在胚胎发育时期的表达及作用已有很多文章阐述,但很少有文章详细分析它们在成体中的表达。为检测这3类microRNA的表达差异,选择BALB/c品系小鼠的股二头肌,提取RNA。设计microRNA专用的茎环状引物,通过实时定量PCR,检验miR-1、miR-133、miR-206和miR-181a在骨骼肌组织中的表达情况。结果发现,miR-133的表达量要明显高于miR-1和miR-206,miR-1略高于miR-206的表达量,作为对照,miR-181a的表达量非常微小。分析该现象,根据资料和网络软件预测,绘制这3类microRNA对肌肉生长发育作用的关系图,初步解释各种microRNA之间呈现表达差异的原因。为下一步研究成体中microRNA及其靶位点提供依据和方向。 相似文献
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猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 总被引：8，自引：1，他引：8
提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性 相似文献
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《畜牧兽医学报》2018,(11)
为了探索β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ruminal epithelial cells,RECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本研究首先建立绵羊RECs培养体系作为体外试验模型,用不同浓度(0、5、10、20、50和100μg·mL~(-1))的β-葡聚糖刺激RECs 8h后,利用qPCR和ELISA方法检测RECs中SBD-1的表达变化,选出诱导SBD-1表达最高的β-葡聚糖浓度。然后用β-葡聚糖的最佳刺激浓度对RECs分别刺激0、2、4、8、12和24h,同样利用qPCR和ELISA方法对RECs SBD-1的表达变化进行检测,从而筛选出诱导SBD-1表达最高的刺激时间。qPCR和ELISA结果显示,β-葡聚糖(5～100μg·mL~(-1))刺激RECs 8h后,SBD-1mRNA和蛋白的表达随着β-葡聚糖浓度的升高均呈现先升高后降低趋势,且当β-葡聚糖浓度为10μg·mL~(-1)时SBD-1mRNA和蛋白的表达量极显著高于对照组(P0.01)。当用10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 0～24h后,qPCR结果显示,10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 2h时SBD-1mRNA的表达量最高(P0.01),之后呈下降趋势,而ELISA结果显示,在β-葡聚糖浓度为10μg·mL~(-1)刺激RECs 4h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高(P0.01)。MTT测定结果显示,100μg·mL~(-1)β-葡聚糖会对绵羊RECs活力产生显著的影响(P0.05)。本研究结果表明,β-葡聚糖能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且用浓度为10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖分别刺激RECs 2和4h后SBD-1的mRNA和蛋白表达达到最高。 相似文献