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1.
《中国预防兽医学报》2017,(2)
为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、水疱性口炎病毒(VSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV),猪瘟病毒(CSFV)以及猪伪狂犬病病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的参考病毒株序列,选择各病毒的保守序列设计5对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种可以同时快速检测以上5种病毒的多重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对不同的细菌或病毒模板扩增结果均为阴性,特异性强;敏感性试验表明该方法对PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少检出量分别为8.82×10~3拷贝/μL、6.87×10~4拷贝/μL、5.71拷贝/μL、4.93×10~4拷贝/μL和4.32×10~2拷贝/μL。以上结果表明该方法快速、灵敏、特异性强,对以上5种猪病病毒能够进行快速鉴别检测,为其临床诊断与流行病学调查提供了有效的检测方法。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2017,(11)
为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸道综合征病毒(HP-PRRSV)的方法,本研究根据ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和HP-PRRSV NSP2基因,分别设计了3对特异性引物和Taq Man水解探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明,该方法仅对ASFV、CSFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的DNA以及猪流行腹泻病毒和猪流感病毒的c DNA发生交叉反应;该方法对ASFV、CSFV和HP-PRRSV的最低检出量分别为61拷贝/μL、11拷贝/μL和41拷贝/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2.5%,具有良好的重现性。用该方法对276份临床样品进行ASFV、CSFV和HP-PRRSV的检测,所有样品的ASFV检测结果均为阴性,CSFV检测单阳性样品6份,HP-PRRSV检测单阳性样品22份,CSFV和HP-PRRSV检测双阳性样品4份。本研究建立的方法为临床样品中ASFV、CSFV和HP-PRRSV的同时检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2017,(2)
为建立一步法鉴别检测猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与其疫苗株感染的多重PCR方法(m PCR),本实验通过比对分析Gen Bank中登录的CSFV和PRV的相关基因序列分别设计可以区分CSFV与PRV及其疫苗株的5对特异性引物,建立了其多重PCR鉴别检测方法。结果表明,建立的多重PCR方法对CSFV和PRV扩增为阳性,而对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性;最低核酸检测量分别为1.7×10~3拷贝/μL(CSFV野毒株)、9.9×10~3拷贝/μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×10~3拷贝/μL Guizhou-DY)、6.9×10~3拷贝/μL(Bartha-K61)和5.5×10~3拷贝/μL(SA215)。采用该方法对134份可疑临床样品进行检测,结果表明CSFV和PRV疫苗株与野毒株在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的5重感染率分别为2.6%(1/38)、7.7%(2/26)、8.3%(3/36)和8.8%(3/34)。本研究建立的多重PCR方法为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑,为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬的净化提供一种新方法。 相似文献
4.
本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。 相似文献
5.
为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在101~106拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID50/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。 相似文献
6.
《动物医学进展》2021,42(3)
建立二重荧光LAMP方法,检测猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)。根据CSFV E2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PCV2序列的特异性引物和2条标记不同的荧光基团探针,在CSFV探针序列5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PCV2探针序列5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。以设计合成的引物、探针以及LAMP反应试剂建立二重荧光LAMP检测方法区分CSFV和PCV2,对该方法中的反应体系进行优化,并进行特异性、敏感性和干扰性测试以及临床样品验证测试。结果表明,建立的方法可鉴别CSFV和PCV2,特异性试验显示,该方法只检测出CSFV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。该方法最低检测CSFV或PCV2为100拷贝/μL,敏感性好。临床样品的检测结果与荧光定量PCR检测结果一致。建立的CSFV和PCV2二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,可适用于CSFV和PCV2的鉴别检测。 相似文献
7.
为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。 相似文献
8.
食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。 相似文献
9.
《中国兽医杂志》2019,(11)
为了了解猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞上的增殖规律。根据GenBank中CSFV Shimen毒株的NS5A基因保守区域序列,设计1对特异性引物,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立了基于实时荧光定量PCR技术的CSFV检测方法,并对其进行了敏感性、特异性、重复性试验,结果显示,该方法重复性好、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID_(50 )/mL。利用所建立的方法研究CSFV在PK-15细胞上清中的增殖动态,并与TCID_(50)方法绘制的复制动态曲线进行比较。结果显示,两种方法测定的CSFV在PK-15细胞上的复制动态具有一定的平行关系,该方法为研究猪瘟病毒的致病机理及利用体外细胞培养毒生产疫苗提供了试验依据。 相似文献
10.
根据猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列特点,设计3对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪的其它常见病毒无交叉反应;对CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV3种重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。试验表明,研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查。 相似文献
11.
12.
WANG Shu-juan LIU Mei-fen YAN Ruo-qian BAN Fu-guo ZHAO Xue-li MA Zhen-yuan WANG Hua-jun WANG Cui ZHAO Ming-jun 《中国畜牧兽医》2017,44(7):2112-2118
A Real-time quantitative PCR assay for detection of classical swine fever virus (CSFV) was developed using the specific probe and primers designed basing on the E2 gene of CSFV. The Real-time quantitative PCR assay was established using the total RNA of CSFV as template. The specificity, sensitivity and repeatability of the assay were tested, and samples taken from clinic suspicious CSFV infected pigs had been testified by the established assay. The results indicated that the Real-time quantitative PCR assay was successfully established, and showed a good linear relationship at a template range of 101 to 106 copies/μL with a coefficient correlation of 0.999; The specificity of the assay revealed that amplifications were showed on CSFV samples, but other pathogens had no amplifications; The sensitivity of the assay was 10 copies/μL nucleic acid and 1 TCID50/mL virus; Meanwhile,19 positive samples were detected, which were consistent with results of CSFV detected by Nested RT-PCR, cloning and sequencing. The eatablished Real-time quantitative PCR assay was specific, sensitive rapid and suitable for early detection and epidemiological study of CSFV. 相似文献
13.
根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R2=0.999;敏感性高,最低检测限为1×101拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。 相似文献
14.
旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在100~106拷贝·μL-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 相似文献
15.
为建立可以快速同时检测兽用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)3种病原的方法,通过研究比对BVDV 5'-UTR、PCV2 Rep以及PPV NS1基因序列,分别设计合成了3对引物和3条荧光探针,在优化反应条件和反应程序后,建立了一种可同时检测BVDV、PCV2以及PPV的三重荧光定量PCR方法,并对其敏感性、特异性进行了评估。结果显示,建立的三重荧光定量PCR方法灵敏度高,对3种病原核酸的最低检测限均为10 copies/μL;特异性强,与其他相关病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒)均无交叉反应。结果表明,本试验建立的三重荧光定量PCR适于疫苗中外源病毒的检测,可用于疫苗等生物制品质量把控。 相似文献
16.
通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为104 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查. 相似文献
17.
Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 104 copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation. 相似文献
18.
为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。 相似文献
19.
为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 相似文献