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根据GenBank中已发表的犬新孢子虫SAG1基因序列(AF132217),设计了一对含有Kozak序列、起始密码子、终止密码子、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。以含有SAG1基因的重组质粒pMD-18T-SAG1为模板,经PCR扩增获得SAG1基因,利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该片段,回收含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点粘性末端的SAG1基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAX1真核表达载体中,获得重组质粒pVAX1-SAG1,经PCR鉴定、酶切分析和重组质粒的序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
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分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。 相似文献
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犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
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根据国外发表的人致病性大肠杆菌fimC基因序列,在其保守区设计了带有BamHⅠ/HindⅢ酶切位点的一对引物,应用PCR技术以鸡致病性大肠杆菌O2基因组DNA为模板扩增到一个片段,大小约为700bp,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上,并转化于大肠杆菌TG1宿主菌,经酶切和筛选,得到阳性重组质粒.通过对阳性重组质粒核酸序列测定,确定此DNA片段为鸡大肠杆菌fimC基因. 相似文献
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根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。 相似文献
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从绵羊血中分离白细胞,提取绵羊白细胞RNA,利用RT-PCR、PCR扩增绵羊白细胞介素2(OvineIL-2)基因。将OvineIL-2PCR产物与TE载体定向连接,用SaLI和BamHI双酶切重组TE,利用低溶点胶回收500bp大小的片段;将其补平后与PPSD质粒连接,用EcoRI酶切鉴定,找出正向连接重组质粒。用BamHI酶切重组PPSD质粒,低熔点胶回收2500bp大小的片段;将其与经BamHI酶切去磷酸化的PME290表达质粒连接,筛选出阳性重组PME290,即为OvineIL-2基因表达载体。 相似文献
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根据捻转血矛线虫Hc38基因产物(登录号AY749124)保守结构域所在核酸序列设计1对引物,该引物包含Kozak序列、HindⅢ酶切位点、Xba Ⅰ酶切位点.以含有捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域片段的pMD19-T为模板,经PCR扩增获得Hc38基因保守结构域片段,用HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切该片段,回收后将此基因片段克隆至相同酶切回收后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcD-NA3.1-Hc38.经酶切分析、序列测定和PCR鉴定,证实了重组质粒的正确性. 相似文献
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从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础. 相似文献
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试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。 相似文献
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为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献
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腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
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为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台. 相似文献
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运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段. 相似文献
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应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
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貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。 相似文献