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1.
《中国兽医杂志》2015,(6)
为了研究犬γ干扰素在抗病毒方面的应用价值,依据乳酸菌密码子的偏好性和原核表达载体p AMJ399的特点,在不改变编码蛋白的基础上,将原有的犬γ干扰素序列重新优化,构建重组乳酸乳球菌p AMJ399-Ca IFNγ/PSM565,获得了分泌表达的犬γ干扰素蛋白,将培养p AMJ399-Ca IFNγ/PSM565的培养上清液进行5倍浓缩后与MDCK细胞进行作用24 h后,接种VSV病毒,通过观察病变、MTT法检测活细胞数及荧光定量PCR检测方法,均证实该蛋白能够抑制VSV的复制,具有明显的抗病毒活性。为进一步研究犬γ干扰素在临床上的抗病毒应用和作为细胞因子佐剂的研究奠定了基础。 相似文献
2.
为研究犬的γ干扰素(IFN-γ)对犬流感病毒H3N2亚型的抑制作用,由经ConA诱导过的健康犬淋巴细胞中特异性地扩增犬IFN-γ(cIFN-γ)基因,构建重组原核表达载体pET-cIFN-γ,转化宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以MDCK-VSV法对纯化后产物进行抗病毒活性鉴定,并在MDCK细胞上测定对H3N2亚型犬流感病毒的抑制作用。结果表明,表达产物以包涵体形式存在,经变性、复性、纯化后,所制备犬IFN-γ的抗病毒活性为1.1×10~5 U/mg,重组犬IFN-γ稀释2~6倍后对犬流感病毒的增殖仍具有明显抑制作用。本研究成功表达了具备抗H3N2亚型流感病毒活性的犬IFN-γ,为犬流感病毒新型药物的开发奠定了基础。 相似文献
3.
本研究将人工合成的犬干扰素α2成熟区序列插入原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-28a-Ca IFN-α2;然后将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,分子量约为23 k Da的目的蛋白表达,表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。包涵体蛋白经变性、复性和纯化处理后,获得的重组Ca IFN-α2纯度为92%;用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组蛋白的抗病毒活性为3.16×106/m L。本研究结果为进一步研制新型犬用干扰素制品奠定了物质基础。 相似文献
4.
为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果，根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列，使用Linker连接合成目的序列，成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明，rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性，且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优；rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes, ISGs)的mRNA转录水平，且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述，本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用，其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。 相似文献
5.
梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定 总被引：1，自引：1，他引：1
提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定. 相似文献
6.
为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。 相似文献
7.
为了解重组虹鳟Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)IFNa的抗病毒效果,本研究根据NCBI中登录的虹鳟IFNa基因序列(AM489418)设计引物,PCR扩增IFNa基因,并构建重组质粒pET32a(+)-IFNa,在大肠杆菌中诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,获得的重组IFNa(rIFNa)蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,大小约为35 ku;重组蛋白纯化后经western blot检测,结果显示rIFNa蛋白大小符合预期;通过细胞病变抑制法检测了rIFNa蛋白的抗病毒活性,结果显示rIFNa蛋白的生物活性与其浓度呈正相关关系,抗病毒效价约为1×10~4U/mg。以上结果表明,原核表达的虹鳟rIFNa蛋白具备较好的抗病毒活性。本研究为后续研究rIFNa蛋白作为免疫增强剂抵抗病毒感染奠定了基础。 相似文献
8.
重组犬α2干扰素的原核表达及其抗病毒活性评价 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在构建犬α2干扰素(CaIFN-α2)大肠杆菌表达系统,并进行优化和筛选,评价其表达的重组犬α2干扰素的抗病毒活性。根据GenBank中CaIFN-α2的基因序列,按大肠杆菌密码子偏好性对CaIFN-α2全基因序列进行优化与合成,连接至pET-32a表达载体中,构建pET-32a-CaIFN-α2重组表达质粒。设计1对含NdeⅠ/BamHⅠ酶切位点的特异性引物,克隆CaIFN-α2成熟肽基因,连接至pET-21a表达载体中,构建pET-21a-CaIFN-α2重组表达质粒。将两种重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物均以包涵体形式存在。表达菌经超声破碎、变性、复性和分子筛层析后,得到纯化的CaIFN-α2蛋白,纯度约为90%。采用细胞病变抑制法在MDCK-VSV系统中测定其抗病毒活性,结果显示,纯化后pET-32a-CaIFN-α2蛋白的抗病毒活性为1.5×103IU/mL,而纯化后pET-21a-CaIFN-α2蛋白的抗病毒活性高达1.0×107IU/mL。本试验结果表明CaIFN-α2在pET-32a及pET-21a载体系统中均能成功表达,且具有抗病毒活性,但在pET-21a载体系统中表达产物的活性更高,试验结果为进一步开发和利用犬干扰素制剂奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(8)
为表达重组鸭γ-干扰素(DuIFNγ),并鉴定其在体内、体外抗病毒活性,本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中登录的DuIFNγ序列进行优化并合成,将其克隆至p ET30a-ELP表达载体中进行重组蛋白诱导表达,并利用类弹性蛋白多肽(ELP)的可逆相变循环特性进行纯化,结果显示,重组蛋白(rELP-DuIFNγ)正确表达,纯化后的rELP-DuIFNγ纯度达90%以上。通过细胞病变抑制法,在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中检测rELP-DuIFNγ体外抗病毒活性,结果显示,rELP-DuIFNγ在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中的抗病毒活性分别为为4.17×10~4U/mg和4.54×10~5U/mg。利用雏鸭感染DHAV-1,同时灌服rELP-DuIFNγ,观察并计算雏鸭发病时间与存活率,初步研究rELP-DuIFNγ的体内抗病毒作用,结果显示r ELP-DuIFNγ在体内可以延缓雏鸭发病时间、降低其发病率。以上结果表明,rELP-DuIFNγ在大肠杆菌中可高效表达,在体内外均具有一定的抗病毒活性。本研究为基因工程DuIFNγ制剂的研制及临床应用奠定了基础。 相似文献
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MultiBac系统是一套完善而又强大的真核表达系统,可在昆虫细胞中大量表达高品质的外源蛋白,已经应用于结构生物学研究和药物开发.为了实现鸡γ干扰素(chIFN-γ)在昆虫细胞中的表达,利用零背景转座技术构建重组杆状病毒,通过感染Sf9细胞,表达并且纯化chIFN-γ蛋白.使用制得的多抗血清,在重组杆状病毒感染的Sf9细胞样品中能够检测到大小为17.8 kD的单一条带,表明chIFN-γ成功表达.对纯化得到的重组chIFN-γ蛋白进行生物活性检测,结果显示其抗病毒活性为1.6×104 U/mL,具有良好的生物活性. 相似文献
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在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素 总被引：1，自引：0，他引：1
为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础. 相似文献
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本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。 相似文献
14.
干扰素(IFN)具有广谱的抗病毒作用,利用杆状病毒表达系统安全、高效和后加工过程完整的特点,在家蚕体内表达生产重组绵羊γ干扰素(Ovi IFN-γ)。依据家蚕的密码子偏好性对Ovi IFN-γ基因核苷酸序列进行优化和PCR,并克隆了带有His标签编码序列的Ovi IFN-γ基因序列Ovi IFN-His-Tagged-γ,构建分别插入Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ基因的重组病毒。将2种重组病毒感染家蚕5龄幼虫,Western blot检测蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ成功表达。采用细胞病变抑制法测定蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ的效价为1.6×106U/m L,重组Ovi IFN-His-Tagged-γ的效价为2.8×105U/m L,前者的抗病毒活性强于后者,稀释至2.0×104倍时,能够完全抑制VSV-GFP病毒感染。上述结果为利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内高效、安全生产具有抗病毒活性的重组绵羊γ干扰素提供了试验依据。 相似文献
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为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。 相似文献
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提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α-干扰素(BoIFN-α)成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为牛α-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛α-干扰素对VSV的抗病毒活性为4.26×105U/mL,对IBRV的抗病毒活性为8.91×104U/mL。结果表明,重组奶牛α-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2018,(12)
为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
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本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。 相似文献
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为了表达猪重组α干扰素(rIFN-α)并对它的生物学特性进行研究,本研究采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN-α基因,以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒polFN-α,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导猪rIFN-α获得了表达,其分子量约22 ku.该重组蛋白以包涵体形式存在,其表达量占总菌体蛋白7%.粟用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化,其纯度达到80%以上,包涵体经复性后,在WISH/VSV系统上,采用细胞病变抑制法测定表明,其稀释度在小于1:103时才有抗病毒活性.本实验表达的猪rIFN-α具有一定的抗病毒活性,为研究具有广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义. 相似文献