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参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛干扰素γ基因序列设计引物,从牛外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,采用RTPCR技术,扩增出干扰素γ基因并进行序列分析。琼脂糖凝胶电泳显示牛干扰素γ扩增片段约为500bp。序列分析结果表明,牛干扰素γ基因序列全长517bp,开放阅读框架内501个核苷酸,共编码166个氨基酸,分子质量19.4ku,与参考序列完全一致。克隆序列经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后连接到经同样双酶切的PBV220质粒中,转化入大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆进行温度诱导表达,经SDSPAGE分析,在约19.4ku处有表达的蛋白带,表达产物经免疫荧光染色鉴定为阳性。 相似文献
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鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列测定 总被引：2，自引：0，他引：2
从植物血凝素（PHA刺激的鸭外周血单核细胞提取总RNA，采用RT-PCR扩增鸭Ⅰ型干扰素（DuIFN-Ⅰ）基因。将其克隆到pMD-18T载体中，进行序列测定。克隆到的鸭Ⅰ型干扰素基因与已公布的DuIFN-α核苷酸序列同源性为99.65%。氨基酸序列同源性为98.95%。同时表明，鸭外周血单核细胞在PHA刺激下能够表达Ⅰ型干扰素mRNA。 相似文献
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鸡γ-干扰素基因的克隆及其在原核和真核系统中的表达 总被引：19，自引：0，他引：19
应用一步法逆转录—聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术对罗曼蛋鸡γ_干扰素基因 (CHIFN_γ)进行了扩增。试验结果表明 ,在植物血凝素 (PHA) 5 0 0 μg/mL、细胞浓度 2 .5× 1 0 6/mL、诱导 1 0h,能从外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段。将RT_PCR产物克隆到PGEM_Teasy载体 ,经过限制性酶切分析、测序证实克隆到的CHIFN_γ基因正确 ,命名为PGEM_CHIFN_γ。序列分析表明 ,CHIFN_γ基因与已发表的鸡IFN_γ基因的同源性为 95 .6%～ 1 0 0 % ,氨基酸水平同源性为 92 .8%～ 1 0 0 % ,与鸭IFN_γ核苷酸同源性为 67.5 %。将CHIFN_γ基因克隆到原核表达载体pGEX_6P_1的GST基因的下游 ,经IPTG诱导后表达出了 43kD的融合蛋白 ,超声波裂解后发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,裂解上清无抑制病毒活性 ;然而将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,通过脂质体转染COS_1细胞 ,用鼠抗CHIFN_γ高免血清进行间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果表明在COS_1细胞的细胞膜和胞浆内均有CHIFN_γ表达 ,且细胞病变抑制试验证实 ,转染后细胞培养上清有干扰素活性 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上抑制VSV病毒的效价可达到 1 0 2 4U/ml。这些结果表明真核表达系统对CHIFN_γ基因表达产物的活性有重要影响。 相似文献
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根据Genbank中发表鸡α-干扰素基因序列设计一对引物,采用PCR法从SPF鸡的全血白细胞中克隆了α-干扰素基因(ChIFN-α)。序列分析结果显示,与已发表的ChIFN-α的同源性在98.1%以上,与其他禽类的IFN-α同源性在67.4%以上,其中与火鸡IFN-α同源性在89.8%,而与鸭α干扰素同源性仅为67.4%。将该基因连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒,转入BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE分析,可见一条约19ku的清晰蛋白带,结果表明克隆的ChIFN-α基因在原核中获得表达。 相似文献
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为了研究延边白鹅γ干扰素的生物学特性,本试验采用刀豆素（ConA）刺激延边白鹅外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法扩增鹅γ干扰素基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列和序列分析。结果显示,延边白鹅γ干扰素基因全长495bp,经序列比对发现,克隆到的延边γ白鹅干扰素基因（JX966250）与哈尔滨鹅γ干扰素基因（AY524421）核苷酸序列同源性高达100%,与广东狮头鹅（EU030377）核苷酸序列同源性达99.6%,而三者的氨基酸同源性为100%。本试验成功克隆到延边白鹅γ干扰素基因,为进一步研究鹅干扰素的分子生物学特性和抗病毒作用机理奠定了基础。 相似文献
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参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
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北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析 总被引：9，自引：0，他引：9
应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从伴刀豆球蛋白A（ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素（IFN－γ）基因（DuIFN-γ2）。序列分析表明，DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN－γ基因（AF087134）长度一致，为497个核苷酸，共编码145个氨基酸的成熟蛋白，推测其分子量约17ku。两者核苷酸水平的同源性为99．6％，有2个位置发生非同义变异，其氨基酸序列的同源性为98．6％；与其他禽类同源性为67．0％－68．0％，与人的同源性为34．4％。 相似文献
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为了构建贵州白香猪γ-干扰素真核表达载体,试验以已构建的含有γ-干扰素基因的pMD-GZ-IFN-γ质粒为模版,利用特异性引物进行PCR扩增,得到大小为501 bp的γ-干扰素基因的开放阅读框,将所得IFN-γ基因克隆至经相同双酶切处理后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-IFN-γ。测序结果表明：克隆至pcDNA3.1（＋）的基因序列为γ-干扰素序列,说明γ-干扰素基因真核表达载体构建成功。 相似文献
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鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析 总被引：5，自引：1，他引：5
从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础. 相似文献
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新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建 总被引：4，自引：3，他引：1
为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。 相似文献
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应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致。将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac中,构建了转移载体pFastBac-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ。重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL。表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5d达到高峰。 相似文献
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鸡α干扰素基因的克隆和鉴定 总被引：14，自引：0，他引：14
采用反转录-聚合酶链反应技术，从传染性囊病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中扩增出石岐杂鸡的α干扰素（spzChIFN-α)基因，将包括sqzChIFN-α编码区的cDNA片断克隆到pBssK载体中，并对该片断进行序列测定，核苷酸序列测定结果表明克隆的ChIFN-α基因cDNA片段长度为724bp，和其他ChIFN-α基因的同源性在9左.1%以上，与其它α食干扰素基因的同源性在67.4%以上，其中与鸭α干扰素基因的同源性为67.4%，与火鸡α干扰素基因的同源性为89.8%，推导的石岐杂鸡α干扰素氨基酸序列与其它禽类的α干扰素的同源性在49.2%以上，其中与白来航鸡α干扰素的同源性为96.9%-99%，与鸭和火鸡α干扰素同源性分别为49.2%和80.7%。 相似文献
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应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致.将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Ⅰ中,构建了转移载体pFastBac 1-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10 Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ.重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL.表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5 d达到高峰. 相似文献
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采用RT-PCR方法从乌鬃鹅肝脏中扩增a干扰素（Interferon,IFN-a）基因片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用生物信息学软件Lasergene v7．1DNAStar和在线分析方法对IFN—a基因的核苷酸序列及其氨基酸序列进行了生物信息学分析,同时与GenBank中登录的鸡、鸭和鹅IFN．仅基因核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明,所扩增的IFN—a基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576bp,与鸡、鸭与鹅IFN-a基因核苷酸序列同源性在72．0％～99．7％,遗传进化树显示鸡、鸭、鹅IFN-a因在遗传进化上各处一支。乌鬃鹅IFN-a基因的克隆及生物信息学分析为进一步研究鹅干扰素抗病毒的作用机理奠定基础。 相似文献
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为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。 相似文献