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1.
《上海畜牧兽医通讯》2017,(3)
为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。 相似文献
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为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。 相似文献
3.
《动物医学进展》2020,(6)
H5N8亚型禽流感是传播性极强的人兽共患病,为了简便快速的检测H5N8亚型禽流感病毒,针对H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了同一反应程序下同时扩增HA基因和NA基因的双重荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该检测方法特异性强,不与其他亚型禽流感病毒和禽常见病原发生交叉反应,敏感性可达10copies/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于0.4%;用该方法对108份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定方法检出率一致。综上所述,建立的H5N8亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,为H5N8亚型禽流感的快速诊断和疫情防控提供了一定的技术支持。 相似文献
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《中国兽医杂志》2017,(8)
H3N8亚型犬流感病毒在北美地区广泛流行,并引发犬的呼吸道疾病,但目前中国尚未有犬感染H3N8亚型犬流感病毒的报道。随着近几年宠物贸易的繁盛,犬流感流行区域可能逐渐扩大,增加北美H3N8亚型犬流感病毒传入中国的可能。因此,需要建立一种针对北美H3N8亚型犬流感病毒的快速检测方法。本研究中,我们建立了针对北美H3N8亚型犬流感病毒的HA和NA基因片段的双重RT-PCR检测方法。该方法可特异性地检出北美H3N8亚型犬流感病毒HA和NA基因,而未检出H3N2亚型犬流感病毒及其他亚型流感病毒、犬瘟热病毒、传染性肝炎病毒、犬细小病病毒、副流感病毒;检测方法灵敏度可达0.1 pg/μL。利用该方法对临床样本进行了检测,证实该检测方法可靠。该检测方法的建立为监测北美H3N8亚型犬流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来犬流感病毒的检测。 相似文献
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应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒 总被引：2，自引：1，他引：1
为建立马流感病毒(ETV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型ETV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法.经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应.而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性.该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术. 相似文献
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为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性.同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/mL.批内和批间试验的变异系数均小于1.48％.利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份.该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定. 相似文献
9.
自甲型H1N1(2009)流感病毒于2009年在世界多个国家暴发流行后,许多国家的猪群中检测到该病毒的存在,因此建立快速准确的甲型H1N1流感病毒的检测方法成为迫切需求。本研究针对甲型H1N1(2009)流感病毒NA基因设计特异性引物和探针,建立甲型H1N1(2009)流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。并将该方法与WHO推荐美国CDC建立的检测方法和美国农业部推荐的检测方法进行比较。通过田间试验验证该方法在实际应用中的效果。结果表明:本研究建立的方法对检测甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的灵敏度达到10-6,与WHO推荐的A型流感病毒实时荧光PCR检测方法的灵敏度一致,并且高于美国农业部推荐方法的检测灵敏度(10-5);该方法特异性强,与经典型H1N1和其他亚型流感病毒株无任何交叉反应。与香港兽医化验所进行了检测比对,检测灵敏度和特异性完全一致。近3 800份的田间试验表明,所建立的方法准确可靠。本研究所建立检测方法快速灵敏,检测结果准确可靠,适合用于甲型H1N1(2009)流感病毒的分子生物学检测和监测。 相似文献
10.
为了建立检测H3N8亚型马流感病毒的RT-LAMP方法,根据H3N8亚型马流感病毒HA基因序列,设计了2对LAMP引物,经过优化反应条件,建立了RT-LAMP检测H3N8亚型马流感病毒方法。结果表明,RT-LAMP方法能够在63℃恒温条件下、75min内实现目的基因片段的大量特异性扩增,通过荧光显色就可直接用肉眼判断结果。对H7N7亚型马流感病毒、马动脉炎病毒、马鼻肺炎病毒的核酸无交叉反应,具有较好的特异性;方法的灵敏度比常规RT-PCR的高10倍;该方法操作简便快速、省时省力,而且灵敏度高、特异性强,对H3N8亚型马流感病毒的检测具有实际的应用价值。 相似文献
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甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒检测基因芯片的制备与初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
建立DNA微列阵技术检测甲型H1N1和季节性H1N1流感病毒的方法,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性。通过生物医学数据库甲型H1N1流感病毒及季节性H1N1亚型流感HA与NA基因进行检索和筛选,应用分子生物学软件,进行序列分析、引物及探针设计,并进行验证。试验所设计的探针可以对甲型H1N1流感与季节性H1N1流感病毒进行区分,用该方法检测了长春市CDC送检的6份疑似甲型H1N1流感病毒临床病例,4份阳性,检测结果同实时荧光定量PCR方法一致。结果表明,利用本研究建立的DNA微列阵技术检测甲型H1N1流感病毒方法,特异性和敏感性强,可作为甲型H1N1流感病毒临床标本检测方法。 相似文献
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《中国家禽》2017,(21)
通过数字RT-PCR和实时定量RT-PCR两种方法的比对试验,建立快速检测H9亚型流感的数字RT-PCR方法。利用同一对引物和探针,以梯度稀释的方法测定这两种方法针对H9亚型流感的灵敏性、特异性及重现性。结果显示:两种方法均能够检测出104倍稀释的H9亚型流感病毒,而数字RT-PCR可以检测出单个微滴中的H9亚型流感病毒,其灵敏度性高于实时定量RT-PCR;两种方法的特异性和重复性都较好,对H3N2、H4N2、H6N2等亚型流感病毒均未有扩增反应。数字RT-PCR方法比实时定量RT-PCR具有更高的灵敏度,在快速检测H9亚型流感病毒方面可发挥重要作用。 相似文献
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为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和Taq Man探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×10~3 copies/mL;使用该方法重复检测10次,H7和N9核酸片段检测的变异系数(CV)1%,说明稳定性良好;利用第二代人感染H7N9流感病毒核酸检测试剂国家参考品样品,测得该方法灵敏度为100%(10/10)、特异度为100%(20/20)。结果表明,本研究建立的H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR方法快速、准确、稳定性高、特异性好,为控制流感病毒传播增添了技术手段。 相似文献
14.
为建立可以区分H7N9流感病毒强毒株和弱毒株的方法,通过比对Gen Bank和GISAID中H7N9流感病毒的HA基因序列以及本实验室保存的病毒序列,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H7N9流感病毒强弱毒株的实时荧光RT-PCR方法,同时对该方法的反应体系和反应参数进行优化,并开展特异性和敏感性试验以及临床应用试验。特异性试验显示,该方法具有良好的特异性,对其他常见亚型的禽流感病毒和其他禽病病毒检测均为阴性。敏感性试验显示,该方法对H7N9流感强毒和弱毒HA基因的检测下限分别为0.004 fg和0.1 fg RNA模板,高于两种商品化试剂盒的灵敏度。利用该方法对40株经实验室分离鉴定的H7N9流感病毒进行对比验证,发现检出率和符合率均为100%。结果表明,该方法具有特异、敏感、准确的优点,可用于H7N9流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒株,对H7N9流感病毒,尤其是高致病性流感病毒的早期诊断和有效防控具有重要意义。 相似文献
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猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用 总被引：9，自引：0，他引：9
根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明：该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(12):84-89
为建立简便、快速检测H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,本研究根据H3和N8亚型AIV的HA和NA基因保守序列,设计合成了2对特异性引物和2条Taq Man探针,通过优化反应条件建立了H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR。结果表明:该方法敏感型好,对H3N8亚型AIV检测敏感性达100个模板拷贝数。该方法特异性强,仅对H3和N8亚型AIV检测为阳性;应用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。因此,本研究建立的H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法具有简便、快速、敏感和特异等优点,可为H3N8亚型AIV感染的有效防控提供技术支撑。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(1):91-93
根据Gen Bank中H10亚型和N8亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守序列,分别设计筛选出2对特异性引物,用于H10亚型和N8亚型AIV的检测,优化引物之间的浓度,建立了同时检测H10亚型和N8亚型AIV的双重RT-PCR检测方法。该方法对H10N8亚型AIV可特异性扩增出267 bp(H10亚型)和464 bp(N8亚型)目的条带,对H10Ny(y≠8)亚型AIV仅扩增出267 bp目的条带,对HXN8(x≠10)亚型AIV仅扩增出464 bp目的条带,对其他亚型AIV和常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该方法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限均为104拷贝数/μL。本研究建立的H10亚型和N8亚型AIV双重RT-PCR特异性强、灵敏度高,可同时快速检测H10亚型和N8亚型AIV,为其感染的快速鉴别诊断提供一种简便、快速和有效的方法。 相似文献
19.
利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒. 相似文献
20.
利用新型荧光探针—分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的HA和NA基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用实时荧光定量PCR技术检测H3N2亚型SIV。构建重组质粒pSK-H3和pSK-N2并绘制标准曲线。结果显示,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验的重复性变异系数（CV）均小于3％,表明该方法灵敏度强、特异性好。此方法的建立将为流感病毒H3N2亚型定型检测提供一种快速有效的方法。 相似文献