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1.
以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
2.
为构建表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组疱疹病毒(HVT),本研究将AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表达质粒中,构建了转移载体pUAB-gpt-HA。通过同源重组及霉酚酸筛选技术,将HA基因表达盒插入到HVT US10基因区,构建了一株表达H5亚型AIV HA基因的重组病毒HVT(rHVT-US10-HA)。经PCR、间接免疫荧光、western blot及红细胞凝集试验鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。rHVT-US10-HA的构建为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达 总被引：6，自引：2，他引：4
为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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表达禽流感HA和NP双基因重组禽痘病毒的免疫保护性 总被引：5，自引：1，他引：5
将分别来自禽流感病毒A／Goose／Guangdong／3／96(H5N1)毒株的HA基因和A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)NP基因重组到禽痘病毒基因组中，获得了能同时高效表达这两种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV—HA—NP)。将rFPV—HA—NP经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡，并设亲本禽痘病毒免疫和非免疫对照组。免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)和A／FPV／Rostock／34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒rFPV—HA—NP免疫鸡群后能够诱导产生高水平的特异性抗体，可完全抵抗H5N1毒株的致死性攻击，并可有效阻止H7N1病毒攻击后病毒在泄殖腔的排出。而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明NP在与HA共同表达时，在诱导交叉保护性方面有一定的免疫增强功能。 相似文献
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利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体 总被引：1，自引：0，他引：1
为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。 相似文献
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以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(4)
为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。 相似文献
8.
目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。 相似文献
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10.
将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。 相似文献
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采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA. 相似文献
12.
将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护. 相似文献
13.
经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV/Restock/1/34(H7N1)1.7kbHA基因的cDNA克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4.5,筛选到重组质粒命名为rpBacHisH7HA。测序正确后,在脂质体介导下,与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rBacHisH7HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。 相似文献
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为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。 相似文献
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禽流感病毒血凝素基因在大肠杆菌中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒HAI基因,将HAI结构基因克隆于pGEX-T载体上,测序结果表明插入的片段为HAI目的基因.切下目的基因HAI,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白原核表达载体PGEX-4T-2,获得的重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明HAI基因插入的位置、大小和读码框架均正确.证明成功构建了融合表达载体pGEX-HAI.构建好的重组质粒,经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌BL21中得到了大量表达,经过4 h表达量既达到高峰.融合蛋白GST-HAI的分子量为62KD,以包涵体形式存在.Western-Blot分析表明,融合蛋白能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性. 相似文献
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表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。 相似文献
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猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用 总被引：3，自引：0，他引：3
利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
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根据已知H5N1亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计并合成引物。从H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高保真DNA聚合酶扩增NA基因,构建转移载体pFastBacHTA-NA,并与大肠杆菌DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-NA。在脂质体介导下将rBacmid-NA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达NA蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和激光共聚焦检测蛋白。结果表明:表达的NA蛋白分子量约为53 ku,该蛋白能与H5N1亚型AIV血清发生特异性反应,证明NA蛋白表达正确,具有良好的免疫反应性。 相似文献