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1.
利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。 相似文献
2.
猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。 相似文献
3.
《动物医学进展》2020,(8)
为深入研究新鉴定的"ORF7"蛋白在猪圆环病毒2型(PCV2)感染中的作用,制备了鼠抗ORF7蛋白的多克隆抗体并进行初步应用。首先,克隆ORF7基因,分别构建了重组原核表达质粒pGEX-6p-1-ORF7和重组真核表达质粒pCDH-CMV-Flag-ORF7。将pGEX-6p-1-ORF7进行诱导表达,确定在IPTG 0.8 mmol/L、37℃下诱导12 h表达量最高,且以包涵体形式表达,分子质量大小约为44 ku。将目的蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,第4次免疫后收集小鼠血清,ELISA方法检测其抗体效价为1∶10000,可用于免疫印迹试验检测pGEX-6p-1-ORF7表达的重组蛋白。应用获得的多克隆抗体通过IFA检测PCV2感染的PK-15细胞中ORF7蛋白的表达,Western blot检测pCDH-CMV-Flag-ORF7和pEGFP-N1-ORF2蛋白的表达,结果表明制备的多克隆抗体可用于IFA和Western blot检测ORF7蛋白。研究结果为探究ORF7在PCV2感染中的作用提供了基础材料。 相似文献
4.
猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)目前尚未有商品化诊断试剂盒，为填补行业空白，本研究制备了抗SADS-CoV核衣壳(N)蛋白单克隆抗体并对其序列进行了分析。利用原核表达系统表达SADS-CoV N蛋白并进行纯化，纯化的N蛋白作为免疫源免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、筛选及亚克隆，获得5株能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞株，将其命名为1C10、4B10、6G1、6F3和6E8;此外，利用套式PCR扩增技术获得了抗体可变区基因序列。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明，5株单抗特异性识别Huh7细胞感染的SADS-CoV。ELISA结果表明，5株单抗与纯化的SADS-CoV N蛋白具有良好的反应性，但是，与SADS-CoV反应性分析发现，只有6E8的反应性较好，其余四株均不反应。Western blot结果表明，5株单抗均能特异性识别纯化的以及SADS-CoV感染表达的N蛋白。亚类分型鉴定结果表明，1C10、4B10、6G1和6F3重链为IgG1型，6E8为IgG2a型，它们... 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(9):1489-1493
通过RT-PCR技术扩增了猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1截段基因序列,将扩增的S1基因截段克隆到原核表达载体pET-32α(+)中,构建了重组表达质粒pET-32α-S1,经测序鉴定正确后,转化至感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果显示:重组菌可表达相对分子质量为45 000的融合蛋白,蛋白表达量较高;Western blotting结果显示,表达的S1蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性的免疫反应,表明原核表达的S1蛋白具有良好的反应原性;将纯化后的S1蛋白与蜂胶佐剂按比例混合,作为免疫抗原,免疫产蛋鸡,每隔2周免疫1次,共免疫3次,定期利用ELISA方法检测抗体效价水平,琼脂扩散试验抗体效价最高达到1∶64,收集并纯化卵黄抗体(IgY),SDS-PAGE结果分析纯化效果较好;在人工感染仔猪试验中,卵黄抗体试验组的治愈率为100%,说明卵黄抗体对猪流行性腹泻病具有较好的治疗效果。结果表明:表达的重组S1蛋白具有良好的抗原性,作为免疫抗原免疫产生的卵黄抗体具有较高的抗体效价,为进一步研制猪流性腹泻卵黄抗体生物制剂奠定了基础。 相似文献
6.
SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础. 相似文献
7.
《中国畜牧兽医》2020,(6)
本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
8.
克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。 相似文献
9.
本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
10.
为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:216;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。 相似文献
11.
研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
12.
为高效表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白并制备多克隆抗体,参考牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出822 bp的E2基因片段,经测序鉴定正确后,将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中,鉴定正确后,在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内得到了以包涵体表达形式存在的重组融合蛋白,重组蛋白亲和层析纯化后,免疫印迹鉴定表明重组蛋白能够被牛病毒性腹泻病毒阳性血清特异性识别,具有良好的反应活性.将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价达1∶25 600.本研究所表达的E2蛋白及制备的多克隆抗体,为E2蛋白结构、功能的研究以及抗原表位的鉴定奠定了基础,为进一步开发牛病毒性腹泻病毒快速检测试剂提供了条件. 相似文献
13.
利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。 相似文献
14.
《畜牧与兽医》2020,(7)
试验旨在通过原核表达获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)衣壳蛋白(C),以制备抗C蛋白多克隆抗体。根据BVDV C蛋白的编码序列设计一对特异性引物,利用PCR扩增编码BVDV C蛋白片段,定向插pPET-42a载体中,转化大肠杆菌BL21 Rosetta (DE3) pLysS感受态细胞,筛选重组阳性菌株,IPTG诱导表达,金属离子层析法纯化得到分子质量为45 kDa的重组C蛋白。利用纯化的重组C蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多克隆抗体效价达到1∶25 600。经间接免疫荧光证实制备的多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的反应性。本研究成功制备了BVDV重组C蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
15.
为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。 相似文献
16.
《中国兽医学报》2019,(6):1075-1079
为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。 相似文献
17.
猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。 相似文献
18.
《上海畜牧兽医通讯》2016,(3)
根据GenBank中已经发表的猪巨细胞病毒gB基因序列,选择抗原富集区设计引物,将目的片段克隆后与原核表达载体pGEX-6p-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得重组蛋白,将其纯化后免疫新西兰兔。用间接ELISA测定血清抗体效价,并采用Western blot验证特异性。结果表明:PCR扩增产物的大小与预期结果相符;重组蛋白大小为预期的48ku,主要以包涵体形式存在,纯化获得了可溶性重组蛋白;免疫兔子血清的ELISA抗体效价为1∶256 000,能检测到预期的48ku蛋白条带,获得的重组抗原和免疫血清可应用于猪巨细胞病毒的临床检测。 相似文献
19.
A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。 相似文献