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1.
利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列和（Gly4Ser）2互补序列的基因作下游引物，以pET28a／DAB389（Gly4Set）2EFG为模板，PCR扩增DAB389（Gly4Ser）2αMSH基因片段，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NcoⅠ酶切，并插入原核表达载体pET28a的相应位点，构建了重组表达载体pET28a／DABm（Gly4Ser）2αMSH，在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389（Gly4Ser）2αMSH，转化菌经IPTG、30C诱导5h，用SDS—PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS—PAGE表明，重组蛋白相对分子质量为45870，且表达量达菌体总蛋白量的29．2％。Western blot分析显示，重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合。成功构建表达了重组DABm（Gly4Ser）2αMSH的工程菌株，表达产物具有生物学活性。 相似文献
2.
旋毛虫新生幼虫期特异性T314全长cDNA的克隆及表达 总被引：4，自引：1，他引：3
利用PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长T314cDNA的信号肽祛作后重组到原核表达载体pET-28a。将重组质粒pET28-T314转入克隆菌DH5a和表达菌DE3，分别提取质粒进行酶切，测序鉴定。用KIPTG诱导培养重组表达菌DE3，做菌体裂解物外源表达产物的SDS－PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清，采用Western blot检测T314cDNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示：外源T314cDNA的PCR产物在重组质粒pET28-T314中阅读框架正确；SDS－PAGE分析结果显示：经IPTG诱导后转化菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了1条相对分子质量约为39000的新条带，大小与外源cDNA融合蛋白的理论推导值38800相符；Western blot检测结果显示：T314cDNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫，不存在于成虫与肌幼虫，且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。 相似文献
3.
根据GenBank中旋毛虫53000抗原基因的序列设计引物，用PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p53cDNA，将其克隆到pMD-18T载体，转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析，结果表明，克隆到1176bp的p53cDNA，共编码391个氨基酸。序列分析表明，p53cDNA序列与GenBank中的旋毛虫p53基因序列相比共有12个核苷酸发生改变，二者的同源性为98％，所编码蛋白质氨基酸序列的同源性为98％。将其克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star（DE3），经IPTG诱导表达后获得约48000的重组蛋白。Western blotting检测证实，p53重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别，具有很好的抗原性。 相似文献
4.
破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出1356bp的破伤风毒素C片段基因，该片段是与靶细胞起结合作用的重链C端基因，经DNA序列测定分析，扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AFl54828的同源性达到99．2％。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a（＋），构建成重组表达质粒pET—TetC，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达，经SDS—PAGE蛋白电泳鉴定，表达产物约为50000的重组蛋白，其表达量占菌体总蛋白的33．5％，经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。动物试验证明，此重组抗原具有良好的免疫原性，能保护动物免受破伤风毒素的攻击。 相似文献
5.
本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。 相似文献
6.
本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 相似文献
7.
利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特菌（LM）的溶血素基因hlyA,获得一条大小约为1600bp的目的片段,将其与pMD18-T载体连接,经酶切、PCR鉴定,命名为pMD18-T—hlyA。测序结果显示所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列同源性为99％。利用含有BamHⅠ／XhoⅠ酶切位点引物B从pMD18-T—hlyA扩增不含信号肽序列的目的片段B,获得了大小约为1500bp的基因片段,该片段与pET32a表达载体经BamHⅠ／XhoⅠ处理后进行连接,转化BL21受菌体。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后获得阳性pET32a-hlyA表达重组质粒,将重组菌用终浓度为0．1mmol／L的IPTG进行诱导表达,结果表明重组菌在诱导2h～3h表达量最高,融合蛋白约占菌体的40％,分子量大小约为80ku;利用LM的阳性血清进行Western blot分析,证实该融合蛋白可以被LM阳性血清所识别,为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ELISA诊断方法提供了条件。 相似文献
8.
本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。 相似文献
9.
参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
10.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
11.
本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
提取Trichinella nativa(T.nativa)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(T.spiralis)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠T.nativa和T.spiralis阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。 相似文献
12.
为了获得本地毛形线虫(Trichinella nativa)49 ku ES蛋白的结构基因,用Trizol提取T.nativa肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa49 ku排泄分泌蛋白的结构基因。将PCR产物与T载体连接并经过大肠埃希菌增殖后送检测序。序列测定表明,目的基因TNPG长度为951bp,核苷酸序列同已发表的T.spiralis相应的序列P49同源性为98.63%,所推导的氨基酸序列同源性为99.05%。为T.nativa49 ku ES蛋白结构基因的进一步研究打下基础。 相似文献
13.
利用RT—PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因，并克隆入pcDNA3．1-CT—GFP真核表达载体中构建重组质粒，用该重组质粒在脂质体介导下转染VeroE6细胞，GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达，通过Western—blot分析，细胞裂解液样品中有1条约66ku的条带，可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别，与预计大小一致，说明，真核表达载体pcDNA3．1-CT—GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达，表达产物具有抗原性。 相似文献
14.
根据Gen Bank中已发表的序列(M64242)为参考设计引物,用RT-PCR方法从6个旋毛虫隔离种的成囊前期幼虫中扩增出了49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoR I和BamHI进行单、双酶切鉴定,阳性质粒测序。成功克隆了6个旋毛虫隔离种成囊前期幼虫49 ku ES抗原基因,序列分析结果显示:49 kuES抗原基因的大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同隔离种之间的差异很小。 相似文献
15.
利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。 相似文献
16.
旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选，对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明，WN1 cDNA全长为474bp，含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由117个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为13200，等电点为4．25，N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示，此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a，重组质粒经鉴定后，转化大肠杆菌BL21 star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白，与理论设计完全相符。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。 相似文献
18.
采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。 相似文献
19.
本研究采用RT-PCR技术扩增猪带绦虫六钩蚴TSOL16免疫原基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建TSOL16基因的pGEX-4T-1原核表达载体,用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western blot分析;将所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体验证其免疫原性。结果显示:所克隆的TSOL16基因片段长度为559bp,含有1个402bp的开放阅读框架,编码134个氨基酸,与已报道的猪带绦虫六钩蚴TSOL16基因核苷酸序列同源性为99%;表达的融合蛋白大小为40Ku,并能被猪带绦虫六钩蚴阳性血清所识别;免疫小鼠在1周后即检测到血清抗体,第30d即达到较高水平,说明该融合蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献