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1.
应用PCR方法扩增新型鸭细小病毒(NDPV)VP3基因,将其克隆至原核表达载体pQE1中,获得重组质粒pQE1-VP3。重组质粒pQE1-VP3经优化诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析并利用His标签抗体对表达的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,NDPV VP3蛋白在25℃、IPTG浓度为1.0mmol/L经诱导5h,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为60ku,主要以不溶性包涵体形式存在。纯化复性后,可获得浓度为5.165 mg/mL及纯度为97%的VP3蛋白。获得的重组菌pQE1-VP3以及高纯度的VP3蛋白,为进一步研究NDPV检测方法和新型疫苗奠定了基础。 相似文献
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为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌(Hp)铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
3.
为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
4.
根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列，设计合成了2对引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM—TA2。用BamHⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ双晦切pGEM-TA1和pGEM—TA2．均得到大小为895bp的ShT-A基因片段，分别与pQE30和pET21a（＋）原核重组表达载体连接．构建pQE30-A2和pET-21A，原核重组表达质粒。工程菌M15／pQE30-A2和BL-21／pET-21A1经lPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E．coli细胞产生毒性作用。DNAsis软件分析ShT-A基因序列，发现在513bp处有HindⅡ位点．以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅡ从pGEM-TA。切出1个513bp的截短片段．重新插入表达载体pQE30．经PCR和双酶切鉴定正确后，得到pQE30-A513重组表达质粒．转化E．coli M15经IPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，在20000处出现1条特异性的表达蛋白带．与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析，试截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37．4％，主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明．表达的重组ShT—A513，蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。 相似文献
5.
牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达 总被引：2，自引：3，他引：2
利用RT—PCR的方法从牛蛙皮肤组织中克隆到大小为270bp的片段RCABP，将其克隆到pGEM—T载体，测序获得1个新的碱基序列。将此基因克隆到原核表达载体pQE一80L，获得融合表达质粒pQE一80L／DHFR／ABP，在1％IPTG诱导下进行表达。SDS—PAGE检测表明，重组蛙皮抗菌肽蛋白的表达量占菌体总蛋白的24％，以包涵体形式存在。体外抑菌试验表明，所构建的质粒能在大肠杆菌中表达具有体外抑菌活性的蛙皮抗菌肽，该融合蛋白具有良好的应用前景。 相似文献
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鹅细小病毒不同毒株VP3基因的序列分析比较 总被引：7，自引：0，他引：7
分别将GPV4个分离株通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，并与PMD18-T质粒载体连接，转化到感受态大肠秆菌TG1中，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明：VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP3基因同源性较高(95．64％—99．81％)。但强弱毒株间也存在一定差异。 相似文献
7.
为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性. 相似文献
8.
根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性. 相似文献
9.
根据GenBank中公布的猪O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)全基因合成了FMDV结构蛋白前体蛋白P1基因,同时设计了扩增FMDV结构蛋白VP0、VP1和VP3基因的引物。以P1基因为模板,分别经PCR扩增获得FMDV VP0、VP1和VP3基因。扩增产物克隆于Blunt载体中,酶切后将目的片段连接到原核表达载体SUMO中,构建重组表达质粒SUMO-VP0、SUMO-VP1和SUMO-VP3,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳可见融合蛋白均获得高效表达,融合蛋白表观分子质量分别约为55、48和40 ku。在IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37 ℃,诱导5 h时融合蛋白表达量最大。Western blotting结果表明,融合蛋白均可被FMDV阳性血清识别,反应原性良好。 相似文献
10.
为构建以木糖为选择标记的乳酸杆菌表达载体,根据GenBank登录的E.coli JM109 xylA和xylB基因序列设计引物,以E.coli JM109基因组为模板,扩增xylAB基因,与人工合成的多克隆位点序列MCS基因、去除氯霉素基因的乳酸菌载体质粒pPG2片段及以pPG2载体质粒为模板扩增的repA基因连接,电击转化于L.casei 393感受态细胞,获得以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并命名为pOXM2。为鉴定pOXM2载体表达蛋白的效果,以含猪细小病毒VP2基因的重组质粒pMD-VP2为模板,扩增VP2基因序列,与载体质粒pOXM2连接,产物电击转化L.casei393感受态细胞,获得阳性克隆子pOXM2-VP2。重组菌经诱导,并进行SDS-PAGE及western blot分析。结果表明,有约180ku重组蛋白得到了表达,而且表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白一样的免疫反应特异性。本研究结果表明已成功构建了以木糖为选择标记的乳杆菌表达载体并实现了外源基因的表达,为进一步研究以重组干酪乳杆菌作为口服疫苗或表达功能性蛋白奠定了基础。 相似文献
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口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究 总被引：2，自引：0，他引：2
体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。 相似文献
12.
根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性. 相似文献
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以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCk扩增VP1基因,经EcoRI和和Xho I双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在.Western blot检测到约97 ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应.将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清.该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1:25 600.鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具. 相似文献
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针对重组原核表达载体表达目的蛋白以包涵体形式存在的问题,作者对影响外源蛋白表达的IPTG的浓度、温度、时间等因素均进行了探索,以观察VP1蛋白的可溶性情况。通过PCR技术将VP1基因克隆至pGEM-T载体中,然后将pET-28a(+)和pGEM-T载体分别进行双酶切,构建重组的pET-28a-VP1载体,将重组载体转化至BL21中,诱导后经SDS-PAGE检测可见约29 ku的目的蛋白条带。插入的外源目的蛋白主要以包涵体的形式存在,上清中的可溶性蛋白甚微。试验结果表明,这可能与蛋白本身的氨基酸组成有重要关联。 相似文献
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为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。 相似文献
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利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。 相似文献
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蓝舌病病毒VP7基因的原核表达 总被引：2，自引：1，他引：1
为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础. 相似文献
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利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献