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1.
为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基（TmPKA-C）基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增TmPKA-C基因。将TmPKA-C基因片段连接至pET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELISA分析该蛋白的反应原性。结果表明,TmPKA-C基因开放阅读框的长度为1 032 bp,可编码343个氨基酸。TmPKA-C基因的表达产物主要以包涵体的形式存在,重组蛋白的分子质量大小约42 ku。Western blotting结果表明,该重组蛋白既能与自然感染脑多头蚴的绵羊血清发生特异性反应,又能与人工感染脑多头蚴不同时间段的绵羊血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA分析结果表明,脑多头蚴绵羊血清能与重组蛋白发生特异性反应,进一步证明该重组蛋白的反应原性良好。本研究为筛选脑多头蚴病诊断新抗原奠定了基础。 相似文献
2.
羊脑多头蚴病ELISA试验用抗原制备的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用羊脑多头蚴包囊头节、犬多头多头线虫节片经超速离心制备的抗原以及多头蚴包囊液抗原,分别对32头份羊脑多头蚴病阳性血清和63头份阴性血清进行EISA检测。头节抗原、节片抗原和囊液抗原的阳性率分别为81.25％、78.12％和53.12％,前两者阳性率均高于后者;其阴性率分别为82.54％、79.36％和80.95％。进而以头节抗原对32头份羊脑多头蚴病血清、25头份羊细颈囊尾蚴病血清、12头份羊棘球蚴病血清和7头份羊肝片吸虫病血清以及31头份羊肝片吸虫病阴性血清进行ELISA试验。结果,分别有26头份、9头份、4头份、1头份和1头份为阳性反应。经Dancan’s检验,多头蚴病血清S/N平均值明显地高于多头蚴病阴性血清。从而初步证明头节抗原用于诊断羊脑多头蚴病具有较高的敏感性和特异性。 相似文献
3.
基于重组猪囊虫18 ku抗原的间接ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从猪囊尾蚴中克隆到18 ku蛋白基因,将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接后测序分析.将目的基因亚克隆至表达载体,构建重组质粒pGEX-CE18,经转化大肠杆菌BL21 (DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物.表达的目的蛋白纯化后作抗原建立检测猪囊虫抗体的重组蛋白间接ELISA方法.结果表明,18 ku蛋白基因在大肠杆菌中成功表达,表达产物约为35 ku的融合蛋白,并能被猪囊虫感染血清识别.经薄层扫描分析,表达量占菌体蛋白总量的28%.与商品化ELISA试剂盒平行检测178份阳性血清样品,二者的符合率为98.83%,说明建立的重组蛋白ELISA方法可用于猪囊虫病的诊断. 相似文献
4.
为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。 相似文献
5.
以原头节可溶性粗抗原经Sephadex G-200层析纯化抗原为包被抗原，兔抗羊IgG-HRP结合物为显色剂，建立检测羊脑多头蚴病血清抗体的Dot-ELISA，并以ELISA作平行对照。结果，粗抗原和层析纯化抗原检测86头份羊脑多头蚴病阳性血清，其敏感性分别为94．18％和93．02％，两种抗原的敏感性无显著差异；检测122头份绦虫蚴病阴性血清，18头份棘球蚴病阳性血清，35头份细颈囊尾蚴病阳性血清，其特异性分别为90．29％和95．43％。两种抗原的特异性差异显著。Dot-ELISA和ELISA两种方法的符合率为100％。层析纯化抗原比粗抗原的特异性有了明显提高，而敏感性没有降低。层析纯化抗原和操作术式都具有良好的重复性，Dot-ELISA和ELISA对比试验结果相近，且具简便、快速及不需要复杂设备等优点，是一种检测羊脑多头蚴病血清抗体的理想方法。 相似文献
6.
为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。 相似文献
7.
羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达.以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化.SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性.间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s.经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑.分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好.作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段. 相似文献
8.
为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。 相似文献
9.
为了获得具有反应原性的重组蛋白,以该蛋白建立初步的间接ELISA检测方法。本研究通过RT-PCR从猪粪便中克隆了戊型肝炎病毒（HEV）ORF2与急性期血清反应的抗原决定簇基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,命名为pET32a-ORF2-62,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用1.0mmol/L IPTG进行诱导表达,通过Western-blotting检测其反应原性,并利用镍柱亲和层析纯化所获目的蛋白。结果,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为30 600,Western-blotting显示重组蛋白与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。经方阵滴定确定最佳包被浓度为7.7mg/L,血清最佳稀释比为1∶40。利用大肠杆菌表达的HEV重组蛋白建立了间接ELISA检测方法,此方法的建立为戊型肝炎早期诊断提供了一种快速简便的血清学诊断方法。 相似文献
10.
为原核表达弓形虫的TgERP基因，参照GenBank中弓形虫GTl株的TgERP基因序列设计引物，通过PCR扩增分离的一株猫源弓形虫（TC株）的TgERP基因，将其克隆至原核表达载体pET-28a中，通过IPTG诱导表达蛋白，应用带His标签的重力柱纯化蛋白，采用BCA方法测定蛋白浓度，利用重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果成功表达了TgERP蛋白，且蛋白以上清形式表达，相对分子质量约16 ku。将纯化的重组蛋白pET-28-TgERP作为诊断抗原，初步建立了间接ELISA方法；利用间接ELISA、改良凝集试验（MAT）和间接血凝试验（IHA）3种方法分别检测472份羊、犬、猫血清样品，发现阳性率分别为1.0%、3.8%、3.4%，验证了建立的间接ELISA方法可区分动物感染弓形虫的途径。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
11.
为原核表达Tml6和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头坳原头节基因组DNA为模板分别扩增Tml6和Tm 18杭原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm 16和pGEX-Tml8.转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化.结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肤琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm 16及GST-Tml8重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆杭体特异性识别. 相似文献
12.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
13.
Velmurugan GV Tewari AK Rao JR Baidya S Kumar MU Mishra AK 《Veterinary parasitology》2008,154(3-4):185-192
Toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii, is a disease of economic importance in livestock, especially in sheep and goats, where it causes abortion. Although several serological tests are in use for diagnosis of infection, production of reliable reagents is a constraint. An 814 bp sequence coding for a truncated surface antigen surface antigen 1 (SAG1), a tachyzoite stage-specific protein, as well as a 657 bp sequence coding for granule protein 7 (GRA7), a dense granule protein were PCR amplified from the genomic DNA of T. gondii. The amplified products were ligated in pET-32b(+) and pET-32c(+) expression vectors, respectively and subsequently transformed into BL21(DE3)pLysS cells. A high-level expression of the histidine-tagged SAG1 and GRA7 fusion proteins were obtained after 7h of incubation. The recombinant proteins were purified using Ni-NTA column and were characterized by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot analysis using reference positive sera from goat, rabbit and humans at 1:100 dilution. Subsequently, the diagnostic efficiency of the recombinant proteins, either individually or as a cocktail of the recombinant proteins, was assessed with 56 reference goat sera by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The immunoreactivity of the refolded SAG1 and GRA7 was evidenced by high OD values. The reactivity of the recombinant proteins as a cocktail preparation was more than that of individual proteins in ELISA and could detect accurately the infection in goats. This is the first report of serological detection of caprine toxoplasmosis by ELISA using a cocktail of recombinant Toxoplasma proteins. 相似文献
14.
根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。 相似文献
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荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR Green I real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒.标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5 α及JM109均无交叉反应.该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段. 相似文献
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利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。 相似文献
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为筛选山羊痘病毒(GTPV)的外源基因插入区,本研究以GTPV Pellor株为模板,设计2对引物,PCR扩增AV 41株GTPV_gp024基因相邻上下游长度约1.1 kb的同源重组片段,分别插入质粒pGPT-EGFP中.插入部位在痘病毒双向启动子p11～p7.5启动的报告基因EGFP-GPT上下游,构建转移载体pEG024,并转染已感染GTPV Av 41病毒的LT细胞,经GPT加压筛选7代后得到重组病毒.结果显示,重组病毒稳定表达报告基因EGFP,从而表明GTPV_gp024基因能够作为外源基因的插入区. 相似文献
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稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法. 相似文献
19.
从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。 相似文献
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采用蔗糖密度梯度离心,纯化浓缩犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的细胞培养物,分别设计7,17,11,10和4对引物,构建了49个基因片段的克隆。煮沸裂解法制备质粒DNA,回收PCR扩增产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,与芯片进行杂交检测,淘汰交叉的克隆片段。结果表明:克隆CCV1,CCV2,CCV5和CCV7可特异诊断CCV,克隆FCV6,FCV7,FCV8和FCV9可特异诊断FCV,克隆FIPV2,FIPV7,FIPV8和FIPV9可特异诊断FIPV,克隆PRCV1,PRCV2和PRCV3可特异诊断PRCV,克隆TGEV3,TGEV4,TGEV5和TGEV6可特异诊断TGEV。将这些特异克隆扩增片段重新点制基因芯片,与病毒PCR产物杂交,未发现交叉现象。基因芯片检测比传统PCR敏感1000倍,可有效应用于这5种动物冠状病毒的检测与区分。 相似文献