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本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(3)
丝氨酸整合因子5(Serinc5)是最新报道能够被携带到病毒粒子中的宿主限制性因子,具有抵抗人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染性的作用。与人Serinc5(hSerinc5)具有高度同源性的犬Serinc5存在两种形式,一种为全长基因组编码的犬Serinc5(cSerinc5),另一种为转录剪接体(cSerinc5X2),该剪接体在N端缺少1~37位氨基酸。为鉴定这两种犬Serinc5是否具有抑制HIV-1的复制能力,本研究从犬肾细胞系MDCK中提取犬总RNA,经RT-PCR分别扩增两种犬Serinc5的cDNA,并克隆到pcDNA3.1载体中,构建编码两种犬Serinc5的重组质粒。将这两种重组质粒分别与编码HIV-1野生型或Nef缺失型的质粒共转染293T细胞,收获所产生的HIV-1病毒粒子,通过ELISA方法检测到这两种犬Serinc5对HIV-1病毒粒子的产量无影响。进一步将病毒粒子分别感染TZM-bl细胞,通过荧光强度检测结果显示,与对照组相比,cSerinc5X2对HIV-1感染性无显著抑制作用,而携带cSerinc5的HIV-1感染性与携带cSerinc5X2的病毒和对照组相比降低约9倍(p0.01),表明cSerinc5的N端对于病毒感染活性的抑制具有关键作用。本研究为鉴定Serinc5抗病毒的功能区提供实验依据。 相似文献
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后，S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别，并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响，本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段，并分别克隆至pCAGGS载体中，构建重组质粒pRRRR-Flag、 pSRAS-Flag、 pAAAA-Flag，均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞，48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T；利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系，并均经western blot鉴定。结果显示，上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、 RRR... 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(10)
APOBEC3蛋白家族是一类重要的慢病毒复制的免疫限制因子。慢病毒编码的附属蛋白Vif可以与Cullin5-Elongin B/Elongin C形成E3泛素化连接酶复合物使APOBEC3G(A3G)聚泛素化和降解,从而抑制A3G对病毒的限制。CBF-β为RUNX家族转录辅助因子,可以调节Vif介导的A3G降解作用。为探索CBF-β对非洲绿猴免疫缺陷病毒Vif蛋白(SIVagm Vif)的调节机制以及对A3G降解的影响,本研究通过生化及病毒学方法对SIVagm和HIV-1编码的Vif蛋白与CBF-β作用进行了对比性研究。结果显示,SIVagm编码的Vif对A3G的降解同样需要CBF-β的辅助。当Vif(HIV-1/SIVagm)编码的第38位色氨酸突变成丝氨酸后,CBF-β辅助Vif调节A3G降解的功能显著降低。由此表明,第38位色氨酸对于不同慢病毒编码的Vif与CBF-β的相互作用具有重要作用。由此推测,CBF-β辅助Vif介导的降解A3G的作用在灵长类慢病毒中具有保守性。 相似文献
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利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(10):1658-1664
为对猪圆环病毒iDNA新型疫苗、基因组遗传变异以及基因组结构与功能等研究提供科学依据,运用相关生物信息学软件对猪圆环病毒2型(PCV2)贵州仁怀分离株(GZ-RH1)的基因组遗传特征进行了分析。结果表明,PCV2GZ-RH1株基因组结构与pmws(AF027217)株相比存在较大差异,其ORF2基因的第696位因碱基T的缺失而导致移码突变,致使其缺失了ORF8和ORF11,ORF5和ORF10终止密码子提前,其他ORF相对较为保守。PCV2GZRH1株各编码蛋白中除了ORF4和ORF9外,其余都属于亲水性蛋白,且ORF9含有1段信号肽序列。在ORF1和ORF2编码蛋白的磷酸化位点中,ORF1相对较为保守,而ORF2变异较大。ORF1~3所编码的蛋白除均具有各自的蛋白质家族域外,还预测到一些可能具有特殊功能的结构域,如ORF1编码蛋白的NACHT结构域和ORF2编码蛋白的精氨酸富集区。ORF2编码氨基酸位点熵值分析表明,ORF2蛋白氨基酸序列中包含2个高变区,即第53~91位和185~215位。通过构建进化树显示,GZ-RH1分离株系PCV2b亚型。对GZ-RH1株的密码子偏爱性分析表明,相对于大肠杆菌和酵母而言,昆虫细胞更适合于PCV2ORF2基因的体外表达。 相似文献
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为了解我国野生动物源细小病毒VP2、NS1基因序列和进化特点,用PCR方法获得貉源细小病毒CR86106和猴源细小病毒BJ-22的目的基因片段,对其核苷酸和氨基酸序列进行测定分析.结果显示CR86106和BJ-22细小病毒基因组长均为4 269 nt,其中NS1基因全长2 007 nt,共编码668个氨基酸;VP2基因全长1 755 nt,共编码584个氨基酸.CR86106 VP2蛋白除第300位氨基酸为脯氨酸(P)以外,其余关键氨基酸位点均与猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPLV)一致;BJ-22 VP2蛋白除第323位为天冬酰胺(N)、第564位为丝氨酸(S)以外,其余关键氨基酸位点均与FPLV一致.CR86106 NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.4％～ 99.3％,VP2是97.6％～99.7％;BJ-22 NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.5％～99.4％,VP2是98.1％～99.3％.种系发生分析结果显示,CR86106 VP2和NS1与FPLV亲缘关系较近;BJ-22NS1归到CPV分支,VP2归到FPLV分支且单独分在一支.结果表明,CR86106具有FPLV样细小病毒序列特征,BJ-22具有FPLV和CPV重组病毒特征,为猴源细小病毒的重组现象,研究结果同时也证实了基因重组在FPLV进化过程中起重要作用的推论. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白质研究进展 总被引：2，自引：1，他引：1
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种折叠的正义RNA病毒,属于动脉炎病毒科(Arteriviridae),尼多病毒目(Nidovirales)。除了动脉炎病毒科,尼多病毒目还包括冠状病毒科(Coronaviruses)。15.1~15.2 kb长的PRRSV基因组通过互相重叠的开放性阅读框编码蛋白质。ORF1a翻译过程中产生pp1a多聚蛋白。ORF1b表达产生了 pp1ab多聚蛋白。pp1a和pp1ab经病毒蛋白酶处理后又生成了14个非结构蛋白。一些非结构蛋白为蛋白酶(NSP1、NSP1β、NSP2和NSP4)、RNA-依赖性RNA聚合酶(NSP9)、解旋酶(NSP10)和核酸内切酶(NSP11)。ORFs2-5编码GP2-GP5,ORF6编码M,ORF7编码N蛋白。ORF2b完全包括在ORF2内,表达小的非糖基化E或2b蛋白。相当一部分的囊膜蛋白是nidoviruses所特有的,所有的结构蛋白都是感染所必需的。 相似文献
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
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为了研究Sf9细胞PHB2蛋白(Sf-PHB2)的功能及其对虾白斑综合症病毒(WSSV)极早期基因ie1的转录调控作用,本研究从昆虫细胞Sf9中扩增sf-phb2基因编码区,克隆至表达载体pET30a中,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达6His-Sf-PHB2重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白以... 相似文献
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传染性支气管炎病毒(IBV)为冠状病毒科冠状病毒属成员,基因组为单股正链RNA,长27.6 kb,带有poly ( A)尾.病毒粒子基因组编码6种蛋白,其中位于病毒囊膜表面的纤突蛋白(spike protein , S )是病毒主要的免疫原蛋白基因,IBV纤突蛋白是由2～3个拷贝的S1, S2亚单位组成.由于IBV的特殊的转录合成机制使得S1基因易发生点突变、插入、缺失和基因重组,使得IBV极易产生变异株.S1蛋白具有许多重要的生物学功能,是IBV主要的免疫原蛋白,它能刺激机体产生中和及血凝抑制抗体.因此,根据不同地区的分离毒株S1基因的差异,来确定流行IBV的血清型,研究其分子生物学特性,深入分析IBV的变异原因,进一步揭示IBV分离株的变异机制,对从根本上控制IB,具有重要意义. 相似文献
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试验旨在对牛MARK2、CREB5基因进行克隆和生物信息学分析.首先在GenBank数据库中利用人MARK2和CREB5基因序列比对获得牛的表达序列标签(ESTs)的序列,进行引物设计并利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉中克隆出MARK2和CREB5基因的cDNA序列,补足空缺部分,最终获得牛MARK2和CREB5基因.通过对牛MARK2和CREB5基因的生物学特性进行分析可知:牛MARK2基因的编码区长为2 076 bp,编码691个氨基酸,CREB5基因的编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸;经蛋白质理化性质预测MARK2和CREB5蛋白均为亲水性蛋白;MARK2和CREB5蛋白的磷酸化位点均分布于苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)残基上;MARK2蛋白与CREB5蛋白的二级结构预测以无规则卷曲为主;亚细胞定位预测MARK2蛋白主要分布在细胞质中,CREB5蛋白主要分布在细胞核中,两者均不属于分泌型蛋白;MARK2蛋白保守结构域预测含1个S_TKc和1个UBA功能结构域,CREB5蛋白保守结构域预测含有1个ZnF_C2H2、1个BRLZ功能结构域和5个低复杂度区域且二者均不具有跨膜结构. 相似文献
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人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潜伏感染的形成与AP-1家族蛋白的转录调节作用密切相关。为研究AP-1家族成员JunD分子在HIV-1潜伏感染形成中的作用,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,构建敲除JunD和稳定(过)表达JunD的细胞系;拯救HIV-1假病毒并分别感染对照细胞、JunD敲除以及JunD稳定表达的细胞系,通过荧光素酶技术检测HIV-1前病毒DNA转录水平的变化。结果显示,与对照组相比,JunD敲除显著抑制了HIV-1的复制,而过表达JunD则促进了HIV-1的复制。该结果表明,JunD参与了HIV-1前病毒DNA的转录调控,并可能由此影响HIV-1在宿主细胞内的复制。本实验为研究激活HIV-1细胞潜伏感染的靶点提供了实验数据。 相似文献
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某国际研究小组已证实发现了与HIV-1入侵有关的宿主细胞的一个蛋白家族，因此对该病毒的传播有了更本质的认识。对这些蛋白及其之相关蛋白的研究，将带领人类找到治疗HIV-1和有同样入侵机制的其它病毒疾病的更好方法。和其它囊膜病毒一样，HIV-1首先得侵入宿主细胞，然后将感染传播给其它细胞。HIV的箝制蛋白包含一个特殊的氨基酸序列，该蛋白能启动人肿瘤基因101(TSG101)。然后，HIV病毒利用TSGIOI完成对蛋白排列和囊泡形成机制的控制，并达到自己的入侵目的。 相似文献
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为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VP1)。SDS-PAGE和western blot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白产物的分子量分别为28 ku和30 ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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马传染性贫血病毒(EIAV)属反转录病毒科慢病毒属。EIAV的RNA基因组是慢病毒基因组中最短最简单的,除了编码结构蛋白gag、pol和env外,EIAV基因组还含有三个开放阅读框架,编码慢病毒中常有的Tat和Rev蛋白及S2蛋白。EIAV最吸引人的特点在于大多数受其感染的动物最终会抑制病毒复制而形成长期的隐性持续性感染,而正是由于慢病毒复杂的分子组成机制导致与其相关的慢病毒基因组中病毒蛋白的差异表达。因此,对EIAV主要基因的分子生物学研究对于其他慢病毒疫苗的研制具有重大的意义。 相似文献