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1.
为了建立快速检测鸭出血症病毒(DHDV)的血清学方法,本试验利用浓缩纯化的DHDV作为包被抗原,建立了检测DHDV血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。试验结果表明,抗原最佳稀释浓度为7.06 μg/孔;最佳包被条件为37 ℃ 1 h后,4 ℃包被过夜;待检血清的最佳稀释倍数为1:25。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.44。建立的ELISA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、雏番鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒阳性血清均无交叉反应,结果表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的最大变异系数分别为0.0221、0.0032,显示该方法具有很好的稳定性,与血清中和试验的符合率为100%。该方法快速、简单、特异性好、重复性好,可用于大批量监测鸭群DHDV血清抗体感染情况。 相似文献
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将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和westem-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白δC表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,最佳包被浓度为51μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较.结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰.对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号.对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍.组内和组间变异系数均小于2％,重复性好.该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法. 相似文献
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将鸭呼肠孤病毒小外壳dC蛋白编码基因克隆于原核表达栽体pET32a上，经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析，获得了重组质粒pET32a-σC，转化DH5a大肠埃希氏菌感受态细胞后，经SDS—PAGE和Western—blotting分析，融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应；以0．15mmol／L IPTG诱导，5h后融合蛋白σC表达量可达高峰，分子质量为50ku；融合蛋白纯化后被用作包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA，经对检测条件优化，最佳包被浓度为5μg／mL，标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与琼脂扩散抗体检测法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性。 相似文献
5.
为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。 相似文献
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为建立一种能够快速检测新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的方法,本研究参考GenBank上登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物.经条件优化后,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.对其特异性、敏感性和重复性进行检验.结果显示：该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符,长度为298 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到83.4 pg病毒RNA;而其它病毒：番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒等样品的扩增结果均为阴性.采用该方法对在广东不同地区采集的15份鸭病料样品进行检测,NDRV阳性率为53.33％.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查. 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(9)
为建立鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的方法,本研究分别针对DTMUV E基因与NDRV、MDRV S3基因,设计特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时检测DTMUV、NDRV及MDRV的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅能扩增DTMUV、NDRV及MDRV,与禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DEV)等主要禽源病毒均无交叉反应,特异性强;对DTMUV、NDRV及MDRV质粒标准品的检测下限均为7.5×10~1拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性好。利用该方法与已报道的坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法及NDRV与MDRV双重RTPCR方法同时检测82份临床疑似患病鸭的肝脾组织样品,结果检出阳性样品22份,其中,DTMUV阳性检出率为10.98%(9/82),NDRV阳性检出率为2.44%(2/82),MDRV阳性检出率为13.41%(11/82),检出阴性样品60份。与参考方法的检测结果一致,三者的符合率达100%。本研究建立的方法为临床DTMUV、NDRV及MDRV鉴别检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术支撑。 相似文献
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《中国家禽》2017,(19)
为了开发鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,研究利用灭活纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)FX2010株作为包被抗原,由瑞普(保定)生物药业有限公司连续制备了5批次鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中试产品。该试剂盒对禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒阳性血清和5份SPF阴性质控血清进行的检测均无交叉反应,表明具有较好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数为1.5%~4.2%和2.2%~5.3%,表明产品具有很好的稳定性。应用该试剂盒及中和试验对300份疑似DTMUV阳性血清样品进行检测,结果显示:二者阳性样品符合率为90.12%,阴性样品符合率为93.6%,总符合率为92.7%。研究结果表明,该试剂盒具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可以为鸭坦布苏病毒病的快速诊断及其流行病学调查提供有力的工具。 相似文献
9.
将抗番鸭GPV单抗腹水采用透析法标记异硫氰酸荧光素（FITC）,制备成抗GPV荧光抗体,研制检测GPV抗原的直接免疫荧光诊断方法。结果显示GPV荧光抗体仅与GPV阳性的组织切片或细胞呈现特异性荧光,与番鸭细小病毒（MPV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭副粘病毒（DPMV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）和正常番鸭组织切片不反应;与间接荧光方法的符合率为92．9％。表明GPV荧光抗体具有较好的特异性、敏感性和准确性,可用于临床快速诊断番鸭小鹅瘟病。 相似文献
10.
为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(1)
为建立猪呼肠孤病毒(PRV)抗体间接ELISA检测方法,本研究采用PCR方法扩增PRV GD-1株S1基因,并以原核系统表达其编码的σ1蛋白。以纯化的σ1蛋白作为包被抗原,鹅抗猪Ig G-HRP为检测抗体,建立了PRV血清型3型间接ELISA血清学的检测方法。该方法对其他几种常见猪腹泻病毒均无交叉反应,具有较强的特异性。组内和组间变异系数均低于10%,重复性好。利用该方法和e Bioscience同类ELISA进口抗体检测试剂盒对606份临床样品进行检测,两者符合率为96.2%。本研究建立的方法为进一步开发商品化试剂盒奠定了基础。 相似文献
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本研究克隆了鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)佛山株(Foshan-2009)的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),构建重组质粒p ET32a-NS1。经转化,IPTG诱导表达及SDS-PAGE和Western blot分析表明,NS1蛋白得到了表达,并且能与抗GPV的番鸭血清发生特异性反应。通过棋盘法确定NS1蛋白包被量为0.5μg/孔,待检血清1:50稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:10 000倍稀释时ELISA反应条件最佳,并确定阴阳性临界值为0.399。该ELISA方法特异性强,与番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间重复试验的变异系数分别小于5%和10%;检出率高,GPV阳性番鸭血清的检出率为92%。本研究所建立的间接ELISA方法为鹅细小病毒的血清学诊断和流行病学监测奠定了基础。 相似文献
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为研究鹅源新型鸭呼肠孤病毒的全基因组分子特征及其广西流行株的进化特点,本研究采集广西地区3份发病鹅的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏病料样品,采用多重荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),并以NDRV阳性样品的核酸为模板,采用RT-PCR分段扩增其全基因组并测序,采用BioEdit软件分析其全基因组序列的相似性;采用NetNGlyc 1.0软件预测NDRVσC蛋白N-糖基化位点;通过Mega 7.0软件绘制σ系列基因的系统发育树及RDP5和SimPlot软件分析NDRV全基因组的重组事件。RT-q PCR结果显示,检出1份NDRV阳性样品,经测序及序列拼接,获得一条鹅源NDRV广西流行株G-NDRV-GX-2022全基因组序列,全长23 353 bp,分为L1～L3、M1～M3及S1～S4共10个基因;BlAST分析结果显示,G-NDRV-GX-2022株10个基因与GenBank中相应基因序列的相似性最高为91.2%～98.4%,对应的病毒株均源自中国广东、福建、山东、浙江及湖北等地的NDRV,宿主有野鸭、番鸭、绿头鸭等,表明G-... 相似文献
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鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：8，自引：1，他引：7
为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。 相似文献
15.
新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus, NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)变异而来，可感染雏鸭，引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发，严重影响鸭出栏率，给我国的养殖行业带来巨大的经济损失。为建立一种鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法，用于鸭感染细小病毒的血清学检测和鸭免疫细小病毒疫苗后抗体水平监测，本研究利用生物信息学预测了NGPV YICH株的结构蛋白VP3的抗原表位，选择了抗原富集区域(aa250～525)进行原核表达，经蛋白纯化获得了可溶性的VP3截短蛋白VP3-tr。以VP3-tr为包被抗原，经过棋盘滴定方法优化各个反应条件，建立了NGPV抗体的间接ELISA检测方法。利用优化后的间接ELISA方法对30份GPV阴性鸭血清进行检测，确定阴阳性临界值为0.219。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明，该方法灵敏度较高，特异性良好，不与鸭坦布苏病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸭疫里默杆菌、大肠杆菌病原阳性血清发生交叉反应；批内和批间重复试验的变异系数均小于6%,重... 相似文献
16.
番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达 总被引：3，自引：0，他引：3
应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2017,(2)
为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(3)
根据鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)的3D基因序列和新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck reovirus,NDRV)的S3基因序列,分别设计了1对特异性引物,通过条件优化建立了鉴别DHAV和NDRV的复合RT-PCR方法。该方法对DHAV和NDRV的最低检出量均为100 copies,而对番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)和鸭副粘病毒(Duck paramyxo virus,NDV)的检测结果均为阴性。临床样品的检测结果显示,该方法是一种快速鉴别诊断DHAV和NDRV感染的有效手段。 相似文献
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鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究以鸭病毒性肠炎(DVE)病毒作为包被抗原,建立了检测DVE抗体的间接ELISA诊断方法.应用该ELISA诊断方法检测DVE阳性对照血清,当血清稀释至12800 倍时,结果仍为阳性;检测其它7种鸭病阳性血清结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于10%;该检测方法与血清中和试验的符合率为100%.DVE 活疫苗皮下免疫鸭抗体监测结果表明:鸭免疫后第7d 可以在血清中检测出DVE特异性抗体.本试验建立的诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DVE免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法. 相似文献