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阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究 总被引：1，自引：0，他引：1
阳离子脂质体转染家蚕培养细胞是家蚕基因功能研究的重要技术之一。利用阳离子脂质体Lipofectamine2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]转基因表达载体,对家蚕卵巢细胞BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21进行了外源DNA质量、脂质体用量、转染细胞密度和转染孵育时间等4个转染条件的优化实验,筛选到了阳离子脂质体转染效率最高的细胞系BmN-SWU1。BmN-SWU1细胞的最佳转染条件为:外源DNA0.6μg,脂质体2.5μL,细胞密度1×105mL-1,无血清条件下孵育24 h。此条件下转染效率可达55.08%。用抗生素G418筛选转染后的BmN-SWU1细胞,建立了GFP转基因细胞系。 相似文献
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影响生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞效果的因素研究 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞,探讨质粒转染HeLa细胞最佳条件的4个参数:质粒DNA剂量、脂质体剂量、最佳转染时间和质粒提取方法,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并计算转染率。结果:在六孔细胞培养板上,当DNA/脂质体剂量为1μg/6μg时,转染效率最高,在转染后72 h达到34.02%;当用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒,转染时间为48 h,转染效率最高,达到17.88%。重组质粒pEGS/2SS转染He-La细胞条件是:采用试剂盒(Plasmid Maxi Kit)提取的质粒,DNA和脂质体的剂量分别为1μg与6μg,转染时间48 h,此时的转染效率最高,达17.88%。 相似文献
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为建立脂质体介导的高效体细胞转染体系,采用脂质体TransfastTM包裹编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pCMV-EGFP质粒,转染5～13代山羊胎儿成纤维细胞,并用流式细胞仪检测不同DNA剂量、细胞汇合度、血清、转染时间及脂质体与DNA比例等参数对转染效率的影响。实验发现0.75μgDNA按1∶1的脂质体与DNA比例,在无血清条件下转染汇合50%细胞3h,转染效率最高可达40.7%±5%。4h转染时间、细胞汇合80%及转染体系中有血清会降低转染效率。随着DNA剂量的增加,转染效率呈剂量依赖性增高,但山羊成纤维细胞的活细胞数显著下降。实验表明TransfastTM能高效安全地介导外源基因转染山羊成纤维细胞。 相似文献
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试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。 相似文献
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采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。 相似文献
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利用PCR技术克隆了人类α-actin基因的启动子（约450bp），尝试用去掉启动子的pEGFP—N1作为框架结构，成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-α-actin—P。应用Lipofectamine 2000将所构建的pEGFP-N1-α-actin-P转染入小鼠ES细胞。通过比较，发现在本实验室条件下，质粒DNA浓度以3．0～5．0μg／mL，转染时间约在2～3h最佳。200μg／mL的G418较适宜于靶细胞的转染与筛选。得到表达心肌a—actin和GFP的小鼠ES细胞，基本维持小鼠ES细胞的形态。PCNA染色结果表明，转染后的小鼠ES细胞具有增殖能力。α—actin抗体免疫组化染色结果表明，转染后细胞表达α-actin和GFP，揭示构建的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P转染小鼠ES细胞，可能促进其向心肌细胞分化并对其筛选。 相似文献
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为了评价融合表达抗菌肽TLN-58和人溶菌酶hLYZ双基因重组表达质粒的安全性,试验采用基因重组法将TLN-58和hLYZ基因片段克隆至pEGFP-N1载体,利用转染试剂GeneTwinTW将构建好的重组质粒转染HEK293细胞,RT-PCR验证重组真核质粒在细胞中表达情况;通过DAPI染色、AO/EB染色、CCK-8检测法和流式细胞术测定并分析hLYZ和TLN-58融合基因表达产物的细胞毒性。结果表明:成功构建重组真核质粒pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58,当重组质粒DNA用量为1μg且GeneTwinTW转染试剂用量为3μL时,转染HEK293细胞24 h,为最佳转染条件,重组质粒可成功表达目的基因;DAPI染色和AO/EB染色显示,转染pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58质粒组细胞凋亡与对照组相比,无显著性差异;CCK-8试验测定细胞相对增殖率(RGR)为50%~74%,显示重组质粒的细胞毒性较小;流式细胞术检测发现重组质粒转染细胞与对照组细胞在G1、G2和S期所占的比例均差异不显著。结果表明,重组质粒的细胞毒性较小且对细胞周期无显著影响,为抗菌肽TLN-58和hLYZ的安全性及抗菌应用奠定了研究基础。 相似文献
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构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。 相似文献
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本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2018,(11)
将H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表达载体中,获得重组质粒pNS1-EGFP,经酶切鉴定并测序后,去内毒素提取pNS1-EGFP质粒,在脂质体转染试剂作用下将pNS1-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用倒置荧光显微镜、FCM和Western blot 3种方法检测NS1-EGFP融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选获取稳定细胞系。结果显示,NS1基因正确插入pEGFP-N1真核表达载体,NS1-EGFP融合蛋白读码框架正确;3种检测方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中能够表达;pEGFP-N1和NS1-EGFP稳定细胞系流式细胞仪检测,阳性率分别为95.74%和96.10%,Western blot检测结果发现,HEK293空白细胞和pEGFP-N1稳定细胞系未见任何条带,NS1-EGFP稳定细胞系在51 000处见特异性条带,综上说明稳定细胞系构建成功。本试验为进一步深入研究禽流感病毒NS1基因的生物学功能作铺垫。 相似文献
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为了构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP,并筛选出Lipofectamine 2000介导的高效转染细胞,本试验将柔嫩艾美尔球虫假定蛋白(Et HP)基因扩增后插入真核荧光表达载体pEGFP-N1,构建真核重组荧光质粒pEGFP-N1-Et HP;测序成功后,用Lipofectamine 2000介导pEGFP-N1-Et HP转染4种细胞即Vero、DF-1、BHK、HD-11;用Western blot检测确定Et HP蛋白在4种细胞内的表达,并观察转染48 h后荧光表达情况,计算5个视野内带有绿色荧光的细胞数占细胞总数的比例,从而比较质粒与Lipofectamine 2000比例不同时4种细胞的转染效率[转染效率/%=(带有绿色荧光的细胞数/细胞总数)×100%]。测序结果显示,pEGFP-N1-Et HP构建成功。Western blot检测显示,Et HP蛋白在4种细胞中均成功表达;荧光显微镜观察到4种细胞转染后48 h均出现绿色荧光,表明重组质粒pEGFP-N1-Et HP成功表达。通过转染效率的比较,发现DF-1细胞转染效率均显著高于其他细胞(P<0.0... 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(5):72-76
以鸡巨噬细胞HD11作为研究对象,分别采用5种不同的脂质体试剂转染和电转方法将含有绿色荧光蛋白(GFP)的质粒转入HD11细胞中,然后通过比较并筛选出适合鸡巨噬细胞HD11的最佳转染方法。结果显示:Lipofectamine 2000 Reagent、Attractene Transfection Reagent和Trans IT-2020 Transfection Reagent几种常见的脂质体转染试剂并不适用于HD11细胞转染。而Coming Transfection Reagent、Lip2000 Transfection Reagent脂质体转染试剂和电转可用于HD11细胞转染;其中,Lip2000 Transfection Reagent转染试剂效果最好。在此基础上,通过进一步优化得出:当DNA(μg)和Lip2000(μL)的比例为1∶1.5时转染效率最高。本研究成功筛选出一种有效的鸡巨噬细胞HD11转染方法,为鸡巨噬细胞的转染及其相关研究提供了实验依据。 相似文献
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鸡Bcl—2基因的克隆及其对卵泡闰细胞凋亡的影响 总被引：5，自引：1，他引：4
将鸡的Bcl-2基因克隆到真核表达载体JLV，构建了重组质粒JLVB。0．2μg／孔JLVB重组质粒经脂质体介导转染卵泡颗粒细胞，应用流式细胞术等方法分析了转染Bcl-2基因后原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。与对照组相比，转染后的传代细胞分裂速度较快（P＜0．01），凋亡比率较低，G2／M＋S期细胞比例极显著高于对照组（P＜0．01）。这些结果表明，Bcl-2基因具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用，这种作用是直接的。在转染时间为12h、DNA量为0．3μg/孔的条件下，较好的脂质体介导用量的1．2μL／孔。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(5)
试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P0.01),脂质体方法显著低于对照组(P0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。 相似文献
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为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。 相似文献