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1.
《畜牧兽医科技信息》2017,(9)
猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病,严重危害养猪业的健康发展。正是因为PRV具有强大的外源基因容量、作为载体有使用性广安全性好等的优点,使得PRV成为近年来构建重组疫苗的重要载体。本文对近年来以猪伪狂犬病毒作为载体构建重组疫苗的研究进展作一综述。 相似文献
2.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。 相似文献
3.
本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。 相似文献
4.
猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。 相似文献
5.
本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础. 相似文献
6.
《中国动物传染病学报》2017,(4)
本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合同源重组,以伪狂犬病毒经典疫苗株Bartha-K61为骨架,将其gB基因替换为伪狂犬病毒变异株JS-2012的gB基因,经噬斑纯化、PCR筛选鉴定,获得重组病毒r PRV-BJB。体外生物学特性分析结果显示,重组病毒株r PRV-BJB与疫苗株Bartha-K61具有相似的生长特性和噬斑形态,可作为新型重组伪狂犬病病毒疫苗候选株。 相似文献
7.
为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。 相似文献
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伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。 相似文献
9.
伪狂犬病毒gB基因的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)主要感染猪,能够引起感染动物的死亡和流产,给世界养猪业带来了严重危害。随着分子生物学的发展,伪狂犬病毒的研究取得了显著进展。综述了PRV的主要保护性抗原基因g B的结构特点和功能研究进展以及其编码的糖蛋白g B在PRV疫苗研究和伪狂犬病防控研究中取得的进展。 相似文献
10.
伪狂犬病被国际动物卫生组织(OIE)列为二类传染病,国内外近几年由于伪狂犬病流行正呈上升趋势,以及造成的巨大经济损失,许多国家己经将伪狂犬病列为了重点防疫并计划最终根除的猪病之一。随着分子生物学发展,人们对伪狂犬病病毒的基因结构、基因功能、检测手段以及疫苗预防方法有了更深入的认识。文章就猪伪狂犬病毒基因的结构特点、功能和主要基因变异的研究等方面进行了综述,以期对我国伪狂犬病毒基因及其基因变异的研究提供一定依据,同时结合本实验室对伪狂犬病gE/gB基因建立的多重PCR净化的病原学研究和国家对该病采用gE/gB-ELISA检测血清学净化方法标准进行了综合,为制定猪伪狂犬病防治及净化提供理论参考。 相似文献
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12.
为了研究伪狂犬病毒gB基因的原核表达并制备其单克隆抗体,试验采用含有伪狂犬病毒(PRV)gB蛋白抗原表位的基因作为模板进行扩增,得到大小为588 bp的扩增产物,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化表达菌Transetta(DE3),经诱导表达得到目的蛋白;以纯化后的重组gB蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞。结果表明:表达的重组gB蛋白约为44 ku,以包涵体形式存在,具有良好的反应原性;获得的2株杂交瘤细胞均能够稳定分泌抗gB蛋白的特异性单克隆抗体(McAb)。 相似文献
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以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。 相似文献
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乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建 总被引：7，自引：0，他引：7
设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。 相似文献
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新型猪伪狂犬病流行情况及净化措施 总被引：2，自引：0，他引：2
2011年11月份我国发生新型猪伪狂犬病疫情,导致中大猪、母猪出现典型的伪狂犬症状而死亡。目前,各地分离到的猪伪狂犬病毒(PRV)流行毒株基因组同源性非常接近。通过PCR检测新分离的伪狂犬病毒,测序后发现毒株出现基因变异,与Bartha株比较,其毒力相关基因RR基因第31~36位出现6个连续碱基的缺失,免疫原g B基因的第224~232位发生9个碱基GCCCCGGCC的缺失。毒力基因的变化导致PRV毒株的毒力明显增强。针对我国新型猪伪狂犬病的流行情况、发生原因以及该病对我国养猪业造成的危害进行了分析讨论,对新型伪狂犬病的毒株变异现象、临床新表现、病理新变化以及诊断方法作了阐述,并提出了新型伪狂犬病的防制和净化措施。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(9):1476-1483
参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。 相似文献
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为掌握江西省种猪场猪伪狂犬病病毒的感染状况,对15个已使用猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗免疫的种猪场l 420份送检血清,采用猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行血清学抗体监测,检测出猪伪狂犬病毒gE抗体阳性186份,阳性率为13.1%.结果表明,江西猪群中存在猪伪狂犬病病毒感染,且某些猪场猪伪狂犬病病毒的感染率较高... 相似文献
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广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告 总被引：2，自引：0，他引：2
为了解广西猪伪狂犬病毒的感染状况,应用PCR技术对来自广西46个种猪场的1940份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,阳性率为0;同时对广西25个已使用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗猪场的1455份送检血清,采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测,结果检出猪伪狂犬gE抗体阳性11份,阳性率为0.76%。结果表明,广西猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染,但感染率较低。 相似文献