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《中国动物传染病学报》2016,(6)
为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。 相似文献
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本文利用PCR技术，分别从柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子和孢子化卵囊基因组DNA中出微线蛋白EtMIC-2基因序列，并进行了克隆和核苷酸序列测定，核苷酸序列表明Etmic-2基因包含有二种 cDNA序列，并含有3个内含子，每一个内含子都有真核生物内含子典型剪切共有序列（GT／AG），与二种 cDNA序列比较发现，Etmic-2基因的pre-mRNA可以通过内含子的3端的不同剪切位点而产生不同的mRNA，生成至少两种蛋白异形体，本文从基因序列上解释了EtMIC-2蛋白的二种蛋白异形体产生过程。 相似文献
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利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。 相似文献
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利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(5)
本文采用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,用oliogo(d T)磁珠法纯化m RNA后,采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,原始文库容量为2.14×106pfu/m L,扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/m L,扩增文库的重组率为90%。随机挑取100个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400~1000 bp为主。本研究结果为毒害艾美耳球虫新基因的筛选和功能研究奠定了基础。 相似文献
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为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):448-453
为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)细胞色素bc 1复合物(cytochrome bc1,Cytbc1)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据EupathDB已公布的E.tenella Houghton株Cytbc1基因序列(Contig ID:ETH 00007855)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtCytbc1基因序列,并将其克隆到表达载体pCold43a中,构建重组质粒pCold43a-EtCytbc1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,EtCytbc1的ORF序列(687bp),编码228个氨基酸;重组菌pCold43a-EtCytbc1能成功诱导表达,pCold43a表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。 相似文献
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羊草叶片cDNA文库的构建及部分表达序列标签的分析 总被引：7，自引：2，他引：5
采用SMART技术,以品质优良羊草“吉生一号”叶片为材料,构建了高质量cDNA文库。原始文库滴度达到106cfu/mL,扩增文库滴度接近1011cfu/mL。随机抽样检查结果表明,插入片断大小在0.5~3.0kb,主要集中在1kb左右,其中检测到插入片断大于1kb的占70%,最大达到2.5kb,其重组率达到98%。同时在扩增文库中检测到了羊草维生素E合成途径中的关键酶基因α-生育酚环化酶(TC)及γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的特异信号,挑选307个筛选出了285条EST序列,将得到的117条非重复序列与GenBank中已知序列比对,获得了如3-磷酸甘油醛脱氢酶、光系统Ⅱ蛋白D1、翻译起始因子蛋白、翻译延生因子蛋白、RNaseS-likeproteinprecursor蛋白等基因。羊草高质量的cDNA文库的构建为进一步从分子水平研究羊草及开发利用这一基因资源提供了条件。 相似文献
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Tsuji N Ohta M Kawazu S Kamio T Isobe T Shimura K Fujisaki K 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》1999,61(12):1331-1333
DNA polymorphism in twelve starains of Eimeria tenella isolated from various places in Japan was examined using 1.l kb small subunits ribosomal RNA amplified by PCR. Genetic variation was evaluated by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis. DNA fingerprint patterns were grouped into two, indicating that at least two DNA polymorphisms exist in Japanese E. tenella strains. 相似文献
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亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析 总被引：4，自引：0，他引：4
从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。 相似文献
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An enzyme-linked immunosorbent assay with the recombinant merozoite protein as antigen for detection of antibodies to Eimeria necatrix 总被引：1，自引：0，他引：1
A cDNA library was constructed with Eimeria necatrix merozoite mRNA and immunologically screened by chicken sera against this parasite. One of the positive clones containing an insert of 879 nucleotides, pNP19, showed similarity to part of a published gene expressed in E. tenella merozoite by the homology search system. The inserted DNA was subcloned into baculovirus, and a 35-kD protein was expressed, purified, and used for the antigen in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Antibodies from the chickens vaccinated with the E. necatrix attenuated strain, Nn-P125, were detected from 14 days after vaccination by ELISA. The mean absorbance increased rapidly to a peak around 21 days after vaccination; thereafter, it began to decline. Even though some of the vaccinated chickens showed very low levels of antibody response to the recombinant protein 56 days after vaccination, they were protected against challenge with virulent strain of E. necatrix. The mean absorbances in sera from both vaccinated and nonvaccinated chickens highly increased 14 days after challenge. On the other hand, the antibody was not detected in ELISA when chickens were exposed to other Eimeria species such as E. tenella, E. acervulina, and E. maxima. These results demonstrate that this recombinant protein is suitable for detecting the specific antibody in chickens infected with both attenuated and virulent strains of E. necatrix. 相似文献
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为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×108 CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。 相似文献