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1.
《中国家禽》2019,(8)
根据GenBank已发表的鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因序列,设计合成一对特异性引物从DF-1细胞总RNA的反转录产物中扩增鸡ANXA2基因开放阅读框,通过酶切、连接等方法将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1,构建重组真核表达载体pEGFP-ANXA2。利用脂质体转染法将pEGFP-ANXA2转染至DF-1细胞,24 h后分别检测融合蛋白EGFP-ANXA2在细胞中的表达及亚细胞定位情况。结果显示:成功构建了鸡ANXA2基因的重组真核表达载体pEGFP-ANXA2;将其转染DF-1细胞后得到与预期大小相符的EGFP-ANXA2蛋白条带,荧光显微镜观察显示EGFP-ANXA2主要定位在细胞质。研究结果为进一步开展鸡ANXA2在相关家禽病毒复制中的作用研究奠定了基础。 相似文献
2.
旨在克隆MEF2A基因和构建其真核表达载体,为黄牛种质资源保存利用以及肉牛转基因育种和产业化提供基因资源和育种素材。本研究通过RT-PCR克隆黄牛MEF2A基因CDS区,并将其插入到质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。同时应用生物学软件分析MEF2A基因及其编码蛋白的生物学特性,了解其复杂的调控机能。结果,MEF2A基因的CDS区全长1 494bp,编码498个氨基酸残基。生物信息学分析表明,N端第2～56位氨基酸肽段为MADS-box结构域,第57～77位氨基酸肽段为MEF2结构域;C端没有明显的功能域。成功的构建了含有牛MEF2A基因的真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。 相似文献
3.
鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建 总被引：5，自引：1，他引：4
利用高保真RT-PCR的方法从Poly（I）·Poly（C）诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长Mx cDNA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明：正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。 相似文献
4.
采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。 相似文献
5.
从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。 相似文献
6.
提取HEP-Flury株狂犬病病毒RNA,RT-PCR方法扩增糖蛋白G基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序鉴定和序列分析。之后双酶切下G基因,将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,经卡那霉素抗性、PCR、双酶切及测序鉴定,获得重组单G腺病毒穿梭载体pShuttle-G。应用PCR方法在G基因末端引入口蹄疫病毒2A自剪切肽序列,并克隆入T载体,同时构建含G基因的T载体,分别双酶切回收以上2片段并将他们定向亚克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1,经系列鉴定,成功构建由2A自剪切肽序列连接双G基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dG。转染以上2个表达质粒入Ad-293细胞,荧光显微镜观察到GFP的表达,斑点印迹试验结果显示G蛋白成功表达。 相似文献
7.
采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。 相似文献
8.
试验构建牛朊蛋白(prion protein,PRNP)基因的真核表达载体,为进一步研究牛朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究抗疯牛病转基因克隆牛奠定基础。采用重叠延伸PCR(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)法扩增获得牛PRNP基因序列,并克隆到带有DsRED2报告基因的真核表达载体pDsRED2-N1中,将双酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过荧光显微镜观察转染细胞,并用800 μg/mL G418对转染的细胞进行药物筛选。琼脂糖凝胶电泳显示基因合成的片段大小和构建的载体大小与预期相符;重组表达载体转染BMSC后有红色荧光出现;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。通过SOE-PCR成功扩增了牛PRNP基因序列,并构建成真核表达载体,得到稳定表达目的蛋白的BMSC细胞。 相似文献
9.
为了正确表达禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白,试验拟构建σA基因的真核表达质粒,并将其在人胚肾细胞(HEK293T)中准确表达,参照GenBank中ARV S2基因序列(登录号为KF741763. 1)设计特异性引物,以pMD18-T-σA重组载体为模板,应用PCR的方法扩增σA基因的特异性序列,并将其克隆到p MD18-T载体中,构建重组pMD18-T-σA表达质粒,再用限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ同时双酶切pMD18-T-σA和真核表达质粒pEF1α-HA,将胶回收的σA基因和pEF1α-HA进行连接,构建真核表达质粒pEF1α-HA-σA。真核表达质粒经菌落PCR、双酶切和测序验证正确后,将其转染HEK293T细胞,于24 h后收取蛋白质,通过Western-blot验证目的蛋白。结果表明:本试验成功克隆了ARVσA基因,构建了其真核表达质粒pEF1α-HA-σA,并在HEK293T细胞中表达。说明该蛋白可以在HEK293T细胞中准确表达。 相似文献
10.
为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。 相似文献
11.
以伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约500 bp的DNA片段,对阳性克隆进行测序与分析。结果：所克隆的基因与GenBank上公布的猪白细胞介素2（PoIL-2）基因的同源性为100%,表明试验成功获得了PoIL-2基因的全序列克隆;以该重组质粒为模板进行PCR,扩增出PoIL-2成熟蛋白的基因片段,连接真核表达载体pPICZαA,成功地构建了重组PoIL-2成熟蛋白基因的真核表达载体pPICZαA-PoIL-2;电转化pPICZαA-PoIL-2于巴斯德毕赤酵母X-33,诱导表达后进行表达产物的SDS-PAGE鉴定,结果表明试验成功地建立了重组PoIL-2的酵母表达系统。 相似文献
12.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(7)
为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。 相似文献
13.
根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1( )中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。 相似文献
14.
根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。 相似文献
15.
为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。 相似文献
16.
本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料. 相似文献
17.
根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。 相似文献
18.
为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。 相似文献
19.
鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。 相似文献
20.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础. 相似文献