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1.
猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用 总被引：6，自引：1，他引：5
本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的特异性引物和TaqMan荧光探针，建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测10^1拷贝／μL～10^7拷贝／μL模板范围内具有良好的线性关系，比常规RT—PCR更敏感，可分别检测最少为10拷贝的阳性标准品和1TCID。病毒。用建立的方法检测高致病性变异株HuN4第5代和第65代体外传代细胞毒人工感染6周龄～7周龄仔猪后的0h、3h、5h、7h、10h、14h、21h血清样品，以及HuN4第5代病毒攻击仔猪21d后迫杀的猪的脑、心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织样品病毒含量，结果发现HuN4第5代病毒感染仔猪3d后在血液中迅速复制，并在感染后7d血清病毒含量达到最高峰，接近10^10拷贝／mL。攻毒21d后，上述内脏组织中肺脏含毒量最多，接近10^9拷贝／g。HuN4第65代病毒在人工感染猪后21d的血清病毒含量最高，达到10^6拷贝／mL血清。 相似文献
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本研究选用与鸽源冠状病毒S1基因高变区氨基酸序列同源性很高的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西分离株GX-YL2和对鸡致死率较高的广西分离株GX-YL5对非免疫幼鸽进行人工感染试验,并同时设参考毒株M41组和空白对照组。结果显示,感染后4 d M41、GX-YL5组试验鸽出现呼吸道症状。感染后7 d GX-YL2组试验鸽子出现呼吸道症状。与空白组相比,感染后8 d GX-YL2组鸽子气管内有大量黏液,胰脏充血肿大,肺脏和肾脏充血;GX-YL5组鸽子气管有大量黏液,肺充血,胰脏充血肿大;M41组鸽子气管粘膜肿胀并有黏液,肾脏充血。感染后8 d组织病理学观察见到鸽子气管纤毛上皮细胞肿胀但纤毛完整不脱落,轻微胰腺炎,肺脏充血和出血。感染后28 d未观察到明显的临床、解剖和组织病理学变化。对感染后1、3、7、10、14、21和28 d的泄殖腔棉拭子进行反转录套式PCR扩增,结果表明除了GX-YL2组的一个样品在感染后10d检测结果为阳性外,其余泄殖腔棉拭子检测结果全为阴性。对感染后8和28 d鸽子气管、肺、肾脏、胰脏病毒分离物进行反转录套式PCR扩增,结果表明感染后8 d,M41组的气管、肺、肾脏、胰脏全部阳性,GX-YL2和GX-YL5组的气管、肺、肾脏、胰脏部分阳性;感染后28 d,3个组鸽的气管、肺、肾脏、胰脏病毒检出率均降低,尤其GX-YL2和GX-YL5组更低。整个试验过程未见到致鸽子死亡。研究表明了对鸡具有较强致病能力的鸡源IBV可以感染肉鸽,能在肉鸽体内进行增殖,但对鸽子致病力不强。 相似文献
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《中国家禽》2015,(23)
为全面了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染引起雏鸡多个器官组织病理损伤情况,研究对IBV M41株人工感染SPF雏鸡后不同时间的气管、肺脏、肾脏、哈德氏腺、胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏、胰腺和十二指肠进行病理组织学变化观察,同时应用实时荧光定量PCR方法对气管和肾脏中IBV载量进行检测。结果显示,IBV M41株主要侵害鸡呼吸器官气管和肺脏,分别在感染后第1、3天开始出现病变并持续2~3周。肾脏主要表现为肾小管上皮细胞轻度变性和少量淋巴细胞浸润,从第5天持续到第28天。感染后第5天,免疫器官哈德氏腺、胸腺和法氏囊开始出现不同程度的细胞变性,其中哈德氏腺最严重。感染后第3~21天,脾脏白髓面积增大,局部出现少量异嗜性细胞,病变轻微。感染5 d后,肝脏、胰腺和十二指肠先后出现轻度细胞变性,少量淋巴细胞浸润,持续到第28天。感染后第1~11天气管和肾脏病毒载量维持较高水平,分别在第5、8天达到峰值,气管病毒载量较肾脏高。结果表明,IBV M41株主要侵害鸡呼吸系统,对泌尿、免疫和消化系统也有亲嗜性;不同器官组织损伤程度和持续时间存在差异;气管和肾脏的病毒载量与组织损伤存在相关性。研究首次对IBV M41株感染雏鸡进行系统的组织病理学观察,为了解疾病发展过程、IBV致病机理和病理学诊断提供参考。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西分离株GX-YL5通过滴鼻点眼人工感染14日龄健康非免疫雏鸡,对接毒后1、3、5、7、10、14、21、28、35和42 d试验鸡的气管、肺脏、肾脏、胸腺、腺胃、盲肠扁桃体和肝脏等组织及泄殖腔棉拭子进行IBV的反转录巢式PCR检测,同时对接毒后不同时间的气管、肺脏、肾脏、胸腺、腺胃、法氏囊、脾脏和肝脏进行组织病理学观察。结果表明接毒后的3～21 d,气管、肺脏、肾脏、胸腺、腺胃、盲肠扁桃体和肝脏的病毒检测均为阳性,接毒后42 d肾脏和气管检测结果仍为阳性;接毒后3～42 d泄殖腔棉拭子检测结果为阳性。组织病理学观察见到气管黏液,气管和细支气管纤毛脱落,炎症细胞浸润,肺充血,淋巴细胞浸润,肾脏间质性肾炎以及法氏囊水肿。研究结果表明,GX-YL5株对雏鸡具有广泛的组织嗜性,主要脏器带毒时间21 d或更长,泄殖腔排毒持续至少39 d。 相似文献
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根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法. 相似文献
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研究了由南京地区分离的鸭源流感病毒A/duck/Nanjing/21/95（H9N2？）感染商品来航鸡后，各组织脏器中病毒分离情况和病毒抗原分布。结果表明，禽流感病毒（AIV）可以从肾脏、肺脏、脾脏和心脏中分离出来，接种后3d(PI3），病毒在组织中的分离率最高，且又以肾脏的分离率最高。病毒抗原主要分布在肾小管上皮细胞、呼吸系统单核细胞和少量上皮细胞的胞核内，PI3时病毒抗原的检出率最高。这些结果表明，肾脏是该毒株复制的主要部位，肾脏的病变是病毒直接损伤的结果，而且该株AIV具备在呼吸系统内复制的潜力。 相似文献
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本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV—BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结,胎猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和小肠,进行组织病毒载量测定和组织病理学检测。实时定量PCR检测结果显示,攻毒组母猪的心脏、脾脏、肺脏、肾脏和子宫内膜存在病毒复制,子宫内病毒含量最高;胎猪的心脏、脾脏、肺脏中存在病毒复制。对照组脏器中无病毒复制。病理切片结果显示,攻毒组母猪肺脏出现细支气管性肺炎,脾脏出现淋巴细胞减少,心脏、肝脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结未见明显的组织病理学变化;胎猪的脏器未见明显的病理损伤。对照组未发现组织病理学变化。 相似文献
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应用猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）分别对25日龄和40日龄的SPF仔猪进行气管内注射攻毒。攻毒后每24h致死1头仔猪．用免疫荧光染色检测各脏器内病毒的消长情况。并采血检测抗体。结果．在25日龄的仔猪中．仅3头出现腹泻症状。且很快耐过；剖检可见不同程度的肺部病理变化；攻毒后24h气管和肺脏样品的IFA呈阳性。抗体效价随着时间的延长而增高。40日龄仔猪临床表现和训检变化基本正常。所有的胃肠道样品的IFA均为阴性。结论：气管内注射后，TGEV可在呼吸系统中增殖．但未能在消化道系统中检出。 相似文献
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应用灭光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布 总被引：1，自引：0，他引：1
为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测.结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒栽量峰值期出现在感染后7 d,随后呈下降趋势.HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21 d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变. 相似文献
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鸡白介素8(cIL8)是9E3/CEF4基因编码的一种诱导型趋化因子。用RT-PCR方法,从鸡胚胚体总RNA模板中扩增cIL8的cDNA序列,测序后,将cIL8基因分别克隆入pGEX-6p-1载体和pFastBacI载体进行表达。利用SDS电泳分离原核表达的cIL8融合蛋白,制备鼠抗cIL8血清,并与昆虫细胞表达的cIL8进行免疫荧光(IFA)反应,同时对雏鸡外周血单个核细胞(PBMC)进行生物趋化试验。结果成功扩增了cIL8基因的cDNA序列,在大肠杆菌和昆虫细胞中均能表达,制备的鼠抗cIL8血清能与昆虫细胞表达的cIL8反应。重组cIL8在一定浓度范围内,可使PBMC发生趋化作用,最高趋化指数为4.38±0.49,且是典型剂量依赖的钟形趋化性反应曲线。本研究结果为cIL8的功能研究和探讨马立克氏病病毒类白介素8(vIL8)的生物学作用奠定了基础。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒(IBV)具有不同致病特性,将IBV XDC-2株接种9日龄SPF鸡胚培养,可引起鸡胚死亡和出现侏儒胚,病毒EID50达5×10-5.33/mL。将IBV XDC-2株接种18日龄SPF鸡,饲养观察14 d,病鸡临床症状表现为:精神沉郁,羽毛凌乱,双翅下垂,轻微腹泻,多数拉白色水样稀粪。病死鸡出现肾肿大、呈花斑状、大量尿酸盐沉积。鸡发病率为100%,死亡率为25%。死亡鸡肺脏、肾组织制作组织切片,发现病理变化明显,主要为:肾小管扩张,上皮细胞呈玻璃样变性,部分管腔内可见坏死脱落之上皮细胞,于肾间质可见大量单核细胞浸润,肾间质有充血、出血现象;肺内动脉、毛细血管充血,淋巴细胞浸润。死亡鸡肺脏、肾组织接种鸡胚分离病毒,RT-PCR检测结果为阳性,表明该分离株为鸡传染性支气管炎病毒,具有很强的嗜肾性。 相似文献
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Guy JS West MA Fuller FJ Marusak RA Shivaprasad HL Davis JL Fletcher OJ 《Avian diseases》2011,55(1):70-75
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鸡胚中人工感染网状内皮增殖病病毒的检测 总被引：3，自引：0，他引：3
为了模仿禽网状内皮增生病毒(REV)垂直感染鸡胚,在1和3日龄的发育SPF鸡胚人工接种不同剂量的REV,并继续孵化至12日龄.在将发育鸡胚制成成纤维细胞单层后,再用抗REV单克隆抗体11B118作间接荧光抗体反应检测REV.结果表明,从所有人工感染REV的鸡胚12日龄制备的成纤维细胞中均能在培养48h检测出REV.该方法可用于检测生产弱毒疫苗的SPF鸡胚及其相应细胞有无REV的污染. 相似文献
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禽白血病给养鸡业带来极大损失,目前检测该病病原的方法主要有ELISA、PCR及RT-PCR、原位杂交(ISH)、间接免疫荧光(IFA)等。本研究应用2株抗禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体5D3和4F12研制了ALV快速检测试纸条。结果证明该试纸条具有良好的特异性,与H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、小鹅瘟病毒、鸡贫血病病毒没有交叉反应;采用p27表达蛋白检测试纸条灵敏性,检测下限达到70ng/mL;应用该试纸条检测71份临床样品,与商业ELISA试剂盒检测结果比较,二者符合率达到93%。该试纸条的研制,为基层快速检测ALV提供了条件。 相似文献
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J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果 总被引：14，自引：0，他引：14
应用特异性抗J亚群禽白血病病毒（ALV－J）的单克隆抗体JE9建立了免疫荧光检测ALV－J抗原和抗体的方法。结果表明，在ALV－JADOL－Hcl感染鸡胚成纤维细胞（CFF）24小时后，可以用1FA检测出阳性细胞，感染72小时后，可以检测出最小病毒感染量≥1．25TCID50／孔。对人工感染ALV－J鸡肾脏冰冻切片检测结果证明，免疫荧光法可以检测出组织中的ALV－J抗原，表现强阳性反应。用重组病毒rBac4817－env感染的Sf9细胞作抗原，可以检测出鸡血清中抗ALV－J的特异性抗体。该方法在ALV－J的控制中必将产生重要作用。 相似文献
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Lamontagne L Page C Larochelle R Longtin D Magar R 《Veterinary immunology and immunopathology》2001,82(3-4):165-182
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) induces a persistent viral infection associated with an inefficient humoral immune response. A study of lymphoid B cells and specific humoral immune response was performed in blood and several lymphoid organs collected from PRRSV experimentally-infected pigs. Groups of specific pathogen-free (SPF) pigs were infected with the LHVA-93-3 isolate of PRRSV, and blood, tonsils, spleen and mediastinal lymph nodes (MLN) were collected at various times postinfection (p.i.) (3-60 days). Lymphoid cells were isolated, immunolabeled for cytofluorometric determination of B cell percentages, used for counting specific anti-PRRSV antibody secreting B cells by an ELISPOT assay, or cultured for metabolic activity. The presence of anti-PRRSV antibodies in the serum of infected pigs was determined using a commercial ELISA assay. Virus detection was performed in all tissues, including lungs, by virus isolation and RT-PCR. The results show that percentages of B cells increased in tonsils as soon as 3 days until 17 days p.i. in PRRSV-infected pigs while they increased in spleen at 3 days p.i. only, due to an increase of larger Ig(high)-producing B cells. Metabolic activity of lymphoid cells from blood and spleen increased at 3 days p.i. only while lymphoid cells from tonsils and MLN transiently decreased at that time and increased thereafter up to 60 days p.i. Anti-PRRSV antibody-secreting B cells occurred in tonsils after 10 days p.i. and strongly increased up to 60 days p.i. However, specific anti-PRRSV-secreting B cells were detected in blood and spleen after 17 days p.i and in MLN only after 45 days p.i. Specific antibodies were detectable in serum at 10 days p.i., reached the maximum level at 45 days and remained high up to 60 days p.i. Infectious virus was detected in lungs and MLN as soon as 3 days p.i., and remained detectable up to 45 days p.i. in tonsils of one pig while viral RNA was detected in most organs up to 60 days p.i. In vitro experiments revealed that inactivated virus induced a stimulation of lymphoid cells isolated from PRRSV-infected pigs while it was cytotoxic for lymphoid cells from control pigs. Taken together, these results indicate that viral infection induced simultaneously a polyclonal activation of B cells, mainly in tonsils, and an exaggerated and prolonged specific humoral immune response due to persistent viral infection in lymphoid organs. 相似文献
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【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。 相似文献