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1.
非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。 相似文献
2.
为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法，以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持，本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理，建立了水貂CDV数字PCR方法，并优化了反应条件，评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明：ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增，其他常见病毒特异性检测结果均为阴性；重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高，重复性好，可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测，对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。 相似文献
3.
旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus, ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列，筛选了特异性探针引物组，采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化，并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较，同时对其他常见禽病病原体进行检测，以及对40份临床样品进行检测，评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍，最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测，结果均为阴性；批内和批间重复性较好，变异系数小。结果表明，所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性，可成功用于快速定量检测ChPV感染。 相似文献
4.
为建立新型高灵敏度的幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,针对幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因设计特异性引物和探针。通过对反应体系优化,建立幼虫芽孢杆菌ddPCR检测方法,并对方法的灵敏度、线性关系、特异性及重复性进行评估。结果:建立的方法与其他6株非幼虫芽孢杆菌无交叉反应,具有良好的特异性;线性关系良好(R^2=0. 991 4);灵敏度为2. 9 copies/μL; ddPCR检测的相对标准偏差(RSD)在0. 93%～5. 27%,重复性好。试验表明本研究建立的ddPCR方法可以对幼虫芽孢杆菌进行绝对定量检测。 相似文献
5.
为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。 相似文献
6.
布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：4，自引：1，他引：3
本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2017,(9)
为了建立伪狂犬病病毒(PRV)微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的检测方法,以伪狂犬病病毒gB基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR方法。对ddPCR反应中的引物浓度、探针浓度、退火温度进行了优化。对建立的ddPCR方法的特异性和敏感性也进行测定,并且应用于临床样品的检测。结果表明,ddPCR的最佳引物浓度为0.9μmol·L~(-1),探针浓度为0.25μmol·L~(-1),退火温度为60℃。ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.998,显示呈良好的线性关系。检测限为6.1copies·μL~(-1),比荧光定量PCR(Real Time PCR,qPCR)的检测限低,变异系数为2.81%,与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,与病毒分离比较,ddPCR方法的敏感性为87.5%,特异性为96.2%,符合率为97%。结果表明新建立的ddPCR方法,敏感性高、特异性强,可用于伪狂犬病病毒的定量检测。 相似文献
8.
为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示：ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R2)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。 相似文献
9.
根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
10.
为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。 相似文献
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布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。 相似文献
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为建立同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法,本研究据GenBank上已发表的具有属间特异性的布鲁氏菌bp26基因和鹦鹉热衣原体23S rRNA基因,利用 Primer Premier 5.0软件各设计1对特异性引物,扩增的目的片段长度分别为219和356 bp。通过优化反应条件,建立了能同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对2种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×102拷贝/反应,双重检测的灵敏度为3.1×103拷贝/反应。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液共172份临床疑似布鲁氏菌感染的样品进行检测,检测到布鲁氏菌阳性样品53份,鹦鹉热衣原体阳性样品2份,以上这2种病原的阳性检出率分别为30.8%和1.2%,且检测到2种病原混合感染的阳性样品2份,阳性检出率为1.2%。临床应用结果表明,该方法可用来对布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体进行同步、快速、灵敏的检测。 相似文献
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本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。 相似文献
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本试验旨在通过快速定量不同发酵时期下发酵豆粕中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的数量,以解决豆粕发酵过程品质监控的瓶颈难题,建立解淀粉芽孢杆菌的实时荧光定量PCR方法。根据解淀粉芽孢杆菌DNA解旋酶A亚基(gyrA)基因及16S核糖体RNA(16S rRNA)基因的保守区设计出3对引物,利用常规PCR筛选出1对特异性引物,并以该引物的扩增产物构建的重组质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行特异性、灵敏性、重复性检验,核酸水平抗干扰验证及豆粕对检测敏感度的干扰验证,最后对发酵的豆粕样品进行定量检测。结果表明:1)以gyrA基因设计的引物构建的质粒标准品建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性;2)该方法检测解淀粉芽孢杆菌核酸和菌液的最低检测限分别为102 copies/μL和103 CFU/mL;3)该方法组内变异系数在0.76%~3.27%,组间变异系数在0.34%~1.88%,均低于5%,说明重复性良好;4)含有与不含副干酪乳杆菌核酸的解淀粉芽孢杆菌的Ct值无显著差异(P>0.05),说明该方法不受检样中其他微生物的核酸干扰;5)该方法对豆粕中解淀粉芽孢杆菌的检测限为104 CFU/mL,比纯菌液最低检测敏感度(103 CFU/mL)降低了1个数量级(但不影响该方法的实际检测应用)。解淀粉芽孢杆菌在不同发酵时期发酵豆粕样品中定量检测结果表明,发酵0 d解淀粉芽孢杆菌的数量为9.33×10^5 copies/g,发酵至5 d接种菌数量为4.16×10^8 copies/g。由此可见,本试验建立的解淀粉芽孢杆菌实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,抗干扰能力强,可快速定量发酵豆粕中的解淀粉芽孢杆菌的数量。 相似文献
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本研究旨在构建1种布鲁氏菌（Brucella）微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度，并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L-1和250 nmol·L-1，最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.12 copies·μL-1，与大肠杆菌O：157菌株等其他4种细菌无交叉反应，而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。 相似文献
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根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
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1种检测新城疫病毒的微滴式数字PCR方法 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在构建一种新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以NDV F基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了NDV ddPCR。对ddPCR反应引物和探针浓度、退火温度进行了优化，并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行测定。试验结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900和250 nmol·L-1，最佳的退火温度为55℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.8 copies·μL-1，与禽传染性支气管炎病毒等其他6种病毒无交叉反应，样本重复的变异系数为2.4%。结果提示，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对新城疫病毒感染的临床样品进行定量检测。 相似文献