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1.
干制辣椒InDel-PCR反应体系的构建及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以干制辣椒叶片为试验材料,筛选适用于InDel-PCR(insertion-deletion-PCR)的DNA提取方法。采用单因素试验设计,对干制辣椒InDel-PCR反应体系进行优化,以及建立干制辣椒InDel的最佳反应体系和扩增程序,利用构建的InDel-PCR反应体系对InDel引物进行筛选。结果表明:植物基因组试剂盒较改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取的DNA质量高、杂质少,更适合InDel-PCR的应用;适用于干制辣椒的InDel-PCR反应体系总体积为15μL,其中模板DNA 2.0μL,正反向引物各1.0μL,2×Go Taq R Colorless Master Mix 7.5μL,其余用dd H2O补齐。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,30次循环;72℃延伸5 min。在上述PCR条件下从60对InDel引物中筛选出25对多态性好、稳定性高的引物。 相似文献
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火龙果EST-SSR分子标记反应体系的建立与优化 总被引：2，自引：0，他引：2
基于火龙果转录组测序序列设计引物,以生物学性状差异明显的11份火龙果种质DNA为材料,采用正交试验设计,对影响火龙果EST-SSR-PCR扩增的2×Taq PCR Master Mix、引物及模板DNA浓度等因素进行了优化,在此基础上对变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度及上样量进行筛选确定。以期建立适合火龙果的EST-SSRPCR最佳反应体系。结果表明,优化后的火龙果EST-SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:10μL混合反应体系含基因组DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL(10-5mol/L)的EST-SSR引物。在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中,10%的变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度、2.5μL上样量扩增效果最佳。该体系的建立可为今后利用EST-SSR标记对火龙果遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供基础。 相似文献
3.
[目的]优化中国兰的ISSR-PCR反应体系,并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物,为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考.[方法]以6个中国兰品种为材料,采集其叶片样品,分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨,比较两种方法提取DNA的效果,利用L25(53)正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化,建立最佳ISSR-PCR反应体系,并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物.[结果]研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法,但二者提取的DNA质量均较好(OD260/OD280为1.7~2.0).对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量.综合考虑成本和DNA模板量,最佳ISSR-PCR反应体系(20.0μL):DNA模板10.0 ng、引物0.8μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0μL.最佳循环数为35,最佳退火温度为49.6℃.基于上述优化结果,从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物.[结论]研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量,且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物,扩增获得的条带清晰、稳定,多样性好,可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究. 相似文献
4.
《福建农业学报》2021,(7)
【目的】优化余甘子种质资源ISSR-PCR反应体系,为余甘子种质资源遗传多样性及亲缘关系研究提供基础。【方法】以缅甸、印度、广东、云南、福建等5份来源不同的余甘子种质资源的基因组DNA组成混合的DNA模板,综合单因素试验和响应面分析法,分析引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火温度等反应条件对ISSR-PCR反应体系的影响,优化建立余甘子ISSR-PCR反应体系。【结果】引物浓度和2×Taq Master Mix添加量对扩增效果有较大影响,DNA模板量影响较小;引物浓度和DNA模板量交互作用明显;余甘子ISSR反应体系为引物浓度0.4μmol·L~(-1),2×Taq Master Mix添加量13μL,DNA模板量30 ng,扩增结果与响应面分析模型理论值相对误差仅为9.39%;退火温度为50.5～52.7℃时,随着温度的升高,条带质量变好,数量变多,退火温度为52.7℃时可获得多样性好的清晰条带。【结论】获得ISSR-PCR反应体系为引物浓度0.4μmol·L~(-1),2×Taq Master Mix添加量13μL,DNA模板量30 ng,退火温度52.7℃,扩增循环数35循环,扩增获得的条带清晰、稳定,多样性好,该体系适于余甘子种质资源的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。 相似文献
5.
以芒果基因组DNA为模板,采用正交试验对模板DNA含量、引物浓度、2×Taq PCR Master Mix含量进行3因素5水平正交试验优化。结果表明,相关序列扩增多态性PCR(sequence related amplified polymorphism,SRAPPCR)最佳反应体系为:30 ng模板DNA、0.3μmol/L引物、10μL 2×Taq PCR Master Mix,总体积为25μL。运用该体系对10份芒果种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从100对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36对引物组合。 相似文献
6.
大白菜InDel-PCR反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用CTAB法提取大白菜基因组DNA,利用单因素试验对InDel-PCR反应体系中的dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA用量、引物浓度、退火温度、三温循环时间等7个因素进行筛选和优化。结果表明,适用于大白菜InDel-PCR分析的最佳扩增条件为(20μL):dNTPs 0.1mmol/L、Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 105ng、引物浓度0.4μmol/L、退火温度50℃、三温循环时间30s-30s-45s。该体系可用于大白菜遗传多样性分析及遗传图谱构建。 相似文献
7.
玉米自交系SSR技术反应体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min. 相似文献
8.
南瓜SRAP扩增体系与扩增程序的优化 总被引：4，自引：1，他引：3
利用L45正交设计对影响南瓜SRAP反应体系的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度及模板DNA浓度等5个因素进行了筛选,快速得到稳定性和重复性好的南瓜SRAP扩增体系。对复性温度、PCR循环次数等影响南瓜SRAP扩增结果的重要因素进行了优化。最终优化的南瓜SRAP反应体系为25μL反应液中:10×buffer2.5μL,0.2 mmol/L dNTPs,引物0.2μmol/L,1.5 mmol/LMgCl2,DNA模板6 ng/μL,Taq酶1.5 U。本研究最终确立的PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,35℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行5个循环,94℃变性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行32个循环,最后72℃延伸5 min。在此条件下得到的SRAP标记可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供稳定有效的手段。 相似文献
9.
花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化 总被引：1，自引：0，他引：1
建立关于花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系,为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础。采用单因素试验法,对影响PCR扩增效果的Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析,并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选。结果表明,适合花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系为:20μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg~(2+)、0.20 mmol/L d NTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×Buffer、8.55μL dd H_2O。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。建立的花吊丝竹的ISSR-PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带,且筛选出的16条引物具有高度多态性。表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性。 相似文献
10.
为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2-浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系.结果表明:最佳反应体系为25 μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,反应程序为94℃预变性4 min,1个循环;94℃变性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min后终止反应,4℃保存.利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段. 相似文献
11.
[目的]优化马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件。[方法]以马齿苋为试验材料,采用改良的CTAB法提取总DNA,对ISSRPCR引物进行筛选,同时进行ISSR-PCR反应体系和反应条件的优化,电泳检测ISSR-PCR产物。[结果]8个ISSR引物适合马齿苋的ISSR-PCR分析;最适反应体系为总体系25.0μL,其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5μL,10μmol/L引物2.0μL,40 mg/L DNA模板1.0μL,dd H_2O 9.5μL;最适反应条件为94℃预变性360 s;94℃变性60 s,54℃退火60 s,72℃延伸90 s,30次循环;72℃再延伸300 s。[结论]建立了马齿苋ISSR-PCR扩增的最佳反应体系和扩增程序,为进一步研究马齿苋提供基础资料。 相似文献
12.
以芒果为材料,通过单因子模板DNA含量、引物含量、2× Taq PCR Master Mix含量3种因素水平进行试验,建立了SRAP反应的优化体系。结果表明：最佳反应体系为20μL ,包括24 ng 模板DNA ,8 pmL引物,2× Taq PCR Master Mix 10.0μL。该体系对芒果扩增效果好,电泳结果显示扩增条带清晰,多态性高,而且操作简单。从81对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的29对引物组合。在此基础上对退火温度进行探索,发现扩增结果对退火温度变化不敏感。 相似文献
13.
《江苏农业科学》2017,(15)
以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对dNTPs、Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA设置7个不同浓度梯度进行研究,并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,dNTPs浓度为0.2 mol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA用量为50 ng,10×PCR buffer体积为2μL、剩余体积用灭菌dd H2O补全。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次;72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。本研究建立了绿竹ISSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为绿竹的指纹图谱、遗传多样性分析、分子育种和品种鉴定等研究提供了基础。 相似文献
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洋葱(Allium cepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化 总被引：3，自引：0，他引：3
为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2 、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2 、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。 相似文献
16.
以野芝麻(Lamium barbatum)DNA为模板,利用单因子试验分别对影响野芝麻ISSR-PCR反应的Mg(2+)浓度、BSA(小牛血清蛋白)、DNA、Taq DNA聚合酶、4 ×dNTP和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定试验的退火温度,最终确定野芝麻最佳的反应体系及PCR扩增程序为:10μL体系,其中包括1×Buffer、Mg(2+),2.5 mmol/L、BSA10 mg/mL、模板DNA15 ng、Taq DNA聚合酶1.5U、4×dNTP0.4mmol/L、引物15pmol;扩增程序:94℃变性5 min;94℃变性30 s,55.2℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃再延伸5 min反应终止.利用优化后的反应条件筛选出10个ISSR引物,并对野芝麻居群进行了遗传多样性分析,多态位点百分率为82.08%,Nei指数为0.1717,Shannon信息指数为0.2381,说明野芝麻遗传多样性水平较高.该体系建立了标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好的扩增条件. 相似文献
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以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。 相似文献
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为探索了解西北地区大蒜及其野生蒜资源之间的亲缘关系及变异特性,以25份西北地区及野生大蒜鳞茎和叶片为材料提取模板DNA,筛选适于简单重复序列(SSR)-PCR的反应体系。采用L16(43)正交表设计正交试验并进行单因素试验,对影响大蒜SSR-PCR的相关体系参数进行优化。结果表明,适用于大蒜的SSR反应体系总体积为10μL:模板DNA 30.0 ng,正反引物均为0.5μmol/L,2×Taq PCR Mix 5.0μL,其余用dd H2O补齐。扩增程序：94℃预变性3 min; 94℃变性30 s,不同引物最佳退火温度退火45 s, 72℃延伸90 s; 30次循环的最后1次循环72℃延伸设为10 min, 4℃保存扩增产物。最终在上述PCR条件下从50对SSR通用引物中筛选出13对多态性好、稳定性高的适用于大蒜SSR-PCR多样性分析的候选引物。 相似文献
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建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。 相似文献