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研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达. 相似文献
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构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况,将增强型水母绿色荧光蛋白基因(EGFP)与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中,与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒,将其感染Sf9细胞制备P1种子液,同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定,确定P2种子液的病毒滴度达1.14×107pfu/mL。将P2种子液以MOI 5~10接种指数期Sf9细胞,3 d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制备重组E0糖蛋白,研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。 相似文献
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通过限制性酶切位点将P12A和3C基因插入到带有双启动子(Pp10和PPH)的杆状病毒表达载体p Fast BacTMDual,转化E.coli DH10感受态细胞进行蓝白斑筛选,将鉴定正确的重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒r Bac-Dual-P12A3C,通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹(Western-blot)检测衣壳蛋白的表达。IFA结果表明表达产物能够被A型FMDV猪抗阳性血清所识别,鉴定正确并具有良好反应原性。Western-blot检测到81 k D(P12A)、57 k D(VP0+VP3)、47 k D(VP3+VP1)、33 k D(VP0)和24 k D(VP1/VP3)5条蛋白条带,与预期相符。该研究为进一步研究A型口蹄疫病毒空衣壳的体外组装提供了试验依据。 相似文献
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为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础. 相似文献
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利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献
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《江苏农业学报》2014,(1)
为同时在昆虫细胞中按照合适比例表达禽腺联病毒的3个结构蛋白质,首先根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转移载体pFastBac-VP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP。SDS-PAGE结果分析表明,3个结构蛋白质VP1、VP2和VP3均获得了表达,分子量正确,且比例为1∶1∶10。Western blot结果显示,表达的重组蛋白质能够与VP3多抗反应。以上结果说明禽腺联病毒的3个结构蛋白质均在昆虫细胞中获得了成功表达。 相似文献
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利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。 相似文献
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O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。 相似文献
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Culliton BJ 《Science (New York, N.Y.)》1983,219(4587):938
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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系.通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80 ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中.诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体.包涵体通过变性、透析与复性,获得纯化的重组蛋白,其中pET30c-M5/BL21 (DE3) 工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5％,纯化后获得了高纯度的重组蛋白(＞95％).比较2种表达载体的表达结果,pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白. 相似文献
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旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。 相似文献
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2006~2007年间，从中国农业大学动物医院采集的犬细小病毒粪便样本中随机抽取20份，采用PCR技术，扩增了这20份样本的犬细小病毒VP2全基因序列。经核苷酸及推导的氨基酸序列分析发现，20个样本中，有19个样本属于CPV-2a，1个为CPV-2b，且所有病毒样本的297位均发生Ser→Ala的置换；基因型为CPV-2a病毒样本的555位均发生回归性置换(Ile→Val)。与经典的CPV-2a/b毒株比较，部分样本还出现了新位点氨基酸置换现象。其中，样本CPV/BJ005/07与CPV/BJ008/07 VP2的139位氨基酸残基由Val置换为Ile；80%（16/20）的样本在324位有Tyr→Ile的置换；样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226（Ser→Asn）与382(Arg→Lys)位发生置换。运用DNAStar软件对上述置换的氨基酸残基进行综合分析发现，除Ile-139突变意义不大外，Ile-324、Asn-226和Lys-382均处在VP2蛋白潜在的抗原表位区域，有着重要的生物学意义。 相似文献
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【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。 相似文献
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虎源猫泛白细胞减少症病毒VP1、VP2和NS1基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
根据Genbank上发表的猫泛白细胞减少症基因序列数据,设计了3对引物,并采用PCR方法对从东北虎粪便中分离出的FPV-HLJ的结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1基因进行了扩增,将各片段克隆至pMD18-T载体,经PCR鉴定后进行了序列测定和分析.结果显示:FPV-HLJ与GenBank上公布的FPV、CPV和MEV毒株相比,核苷酸序列同源率VP1为98.8%～99.8%,VP2 为98.1%～99.4%,NS1为98.6%～99.7%.VP1氨基酸同源率为97.6%～99.2%,VP2、NS1氨基酸同源率与其核苷酸同源率相同.并且VP1、VP2和NS1上分别有 4、3和9处氨基酸发生变异. 相似文献
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[目的]研究塞尼卡病毒A VP1基因的遗传变异情况。[方法]通过RT-PCR方法从广东省2个猪场的病料中扩增出塞尼卡病毒A阳性样品,并对其VP1基因进行了基因组扩增和序列分析。[结果]2个塞尼卡病毒A VP1基因与Gen Bank公布的巴西、美国、中国等毒株的同源性为92%99%,与2002年美国分离株SVV-001的同源性分别为92.8%和92.7%,与我国分离株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性最高达99.1%。通过序列分析发现,毒株VP1基因组存在散在突变点,表明毒株可能存在一定程度的变异。[结论]研究结果可为我国塞尼卡病毒A的深入研究和猪水疱样症状病的鉴别诊断提供参考。 相似文献
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构建一个对虾WSSV VP281基因的siRNA筛选体系,获取有效siRNA,为进一步开展siRNA抗WSSV研究建立基础.根据已报道的VP281基因编码序列,设计并合成一对引物,扩增出带双酶切位点的VP2 81.对VP281和质粒pEGFP-C1分别酶切后进行连接,获取表达载体pEGFP-VP281.利用专业软件设计3对靶向VP281的siRNA(VP281 -siRNA1、VP281-siRNA2、VP281 -siRNA3),并合成siRNA,将3种siRNA分别与pEGFP-VP281共转染PK细胞.采用Western blot方法检测GFP-VP281融合蛋白的表达,半定量RT-PCR方法检验siRNA抑制VP2 81基因转录的效果.结果显示,pEGFP -VP281可在BHK细胞正常表达融合蛋白GFP-VP281.3对siRNA对GFP-VP281的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,siRNA2的干扰效果最为显著.构建针对WSSV-VP281基因的siRNA筛选体系,初步验证了该系统的有效性,为开展siRNA抗WSSV研究建立了基础. 相似文献
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[目的]研究猪轮状病毒VP8与VP7融合蛋白的免疫原性。[方法]表达和纯化了猪轮状病毒VP8、VP7蛋白与TAT转导肽序列的融合蛋白VP8-VP7-TAT以及VP8-TAT、VP7-TAT。将3种融合蛋白分别经腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠,采集免疫小鼠血液和粪便样品,检测血清特异性抗体Ig G和黏膜特异性抗体Ig A水平;期间观察小鼠体重变化;检测融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿肠功能。[结果]腹腔注射组血清中Ig G抗体水平明显高于其他实验组,但其黏膜Ig A抗体水平较低;灌胃组血清中Ig G抗体水平略低于腹腔注射组,但明显高于对照组。灌胃组能诱导较高水平的黏膜Ig A抗体,高于其他实验组;融合蛋白VP8-VP7-TAT诱导产生的血清中Ig G抗体和黏膜Ig A抗体水平均高于VP8-TAT以及VP7-TAT;在实验周期中,各组小鼠体重均正常;融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿肠活性较好,与对照组之间差异极显著。[结论]融合蛋白VP8-VP7-TAT经口服或注射小鼠后,能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答,并且融合蛋白VP8-VP7-TAT经口服可诱导小鼠机体产生较强的黏膜免疫应答。融合蛋白VP8-VP7-TAT相较VP8-TAT、VP7-TAT,能诱导小鼠机体产生更强的免疫应答,具有更强的免疫原性。融合蛋白VP8-VP7-TAT具有穿肠功能。融合蛋白VP8-VP7-TAT经小鼠安全性实验表明具有很好的安全性。 相似文献