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旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID50病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×106cells·mL-1、搅拌转速120 r·min-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×106 cells·mL-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×106cells·mL-1、搅拌转速80 r·min-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID50·mL-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。 相似文献
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旨在应用新型Cephodex D微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟病毒。通过优化工艺条件初步实现了病毒抗原的大规模高效生产,培养过程采用流加方式保证ST细胞的营养供应。用含6%(v/v)无牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)及其抗体的双阴牛血清MEM生长液培养ST细胞。当达到3.8×109个细胞时,接种入生物反应器中,Cephodex D微载体用量为4 g/L。当反应器内ST细胞生长至48 h,接种猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)液。继续培养4 d后进行首次病毒收获,之后每3 d收获1次,直至第5次收毒结束。整个培养过程持续18d,细胞培养至72 h,密度可达2.8×106cells/m L,生产的CSFV滴度均在100万兔体反应量(RID)/m L以上。较现有的国家标准相比,应用生物反应器和新型Cephodex D微载体悬浮培养技术,不仅病毒滴度提高了1倍,而且整个生产周期缩短了5 d,大大提高了生产效率。因此,本研究采用的新型微载体悬浮培养工艺在CSFV大规模生产中具有重要的应用价值。 相似文献
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为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。 相似文献
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为了构建伪狂犬病病毒(PRV)TK/gI/gE三基因缺失重组病毒,试验以PRV-JL14作为母本株,将其基因组与转移载体进行同源重组后,以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为标记基因进行筛选,先后敲除gI、gE和TK基因大部分序列,获得重组病毒PRV-ΔgIgE/TK,并将重组病毒在BHK-21细胞中传代培养并绘制其一步生长曲线,同时以不同剂量对小鼠进行攻毒试验。结果表明:TK、gI和gE基因缺失后的重组病毒基因组稳定,在BHK-21细胞中传代培养20代未见突变;与母本株PRV-JL14相比,PRV-Δg IgE/TK在BHK-21细胞中的增殖能力没有降低,且对小鼠的致病力显著降低。说明试验构建的重组病毒PRV-ΔgIgE/TK可以作为猪伪狂犬病的候选疫苗株。 相似文献
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为了建立水貂源犬瘟热病毒(CDV)的大规模悬浮培养技术，实现细胞高密度生长和病毒高效增殖，本研究应用Cephodex微载体悬浮培养鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，增殖弱毒株CDV3。整个过程采用摇瓶培养法，通过对病毒培养温度、病毒收获时间等关键技术条件进行优化，确立最佳培养条件。结果表明，DF-1细胞37℃培养至72 h,接种CDV3,35℃继续培养72 h收获病毒，病毒滴度每0.1 mL可达105.0 TCID50。CDV微载体悬浮培养技术的初步建立，为高效水貂犬瘟热疫苗的研发生产奠定了重要的基础。 相似文献
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为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化。结果显示：接种细胞初始密度1.00×106 cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养48 h时,细胞数量扩增了4倍且细胞活力高;猪伪狂犬病病毒接种时初始细胞密度2.00×106 cells/mL、感染量MOI=1.0、培养60~72 h,毒价可达109.00 TCID50/mL。结果表明,优化后的培养工艺适用于摇瓶中ST悬浮细胞及猪伪狂犬病病毒的培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高猪伪狂犬病病毒繁殖能力提供了试验依据。 相似文献
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从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织等病料中,经PCR扩增出大小为217 bp的伪狂犬病病毒gp50的基因片段,结果证实为猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)感染。随后采用BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒的分离培养,该分离株经细胞传代培养5代后,能够产生典型的细胞病变,经PCR鉴定为伪狂犬病病毒,其病毒感染力达108.68 TCID50/0.1mL。最后用107.0 TCID50/mL病毒培养物接种家兔,48 h后注射部位出现典型瘙痒、皮肤破损等症状,于72 h后全部死亡。结果表明,该伪狂犬病病毒分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫及诊断研究奠定了基础。 相似文献
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为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异情况，从山东和江苏两地的某发病猪场分别采集阳性病料接种BHK-21细胞，连续传代进行病毒分离，观察细胞病变；对细胞培养物进行间接免疫荧光与蛋白印迹鉴定，通过对病毒滴度的测定绘制了分离病毒株的一步生长曲线；进一步动物试验鉴定分离株的毒力，并对其gE基因进行遗传进化分析。结果显示：利用PCR成功扩增出PRV的gB、gC和gE特异性基因，病料接种BHK-21细胞后产生了特异性细胞病变；病毒感染细胞后表达了gE蛋白，并与抗PRV单抗特异性结合，显示成功分离到2株分离毒株，分别命名为SDWF2019和JSNT2019;通过序列分析，2个分离株与我国新流行的PRV毒株属于同一遗传进化分支。本研究为我国华东区猪伪狂犬病的疫情监测提供了参考。 相似文献
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为了用激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗,采用纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞,接种狂犬病病毒Flury株(LEP),测定病毒液滴度.将收获的病毒液制备兽用狂犬冻干活疫苗,按照狂犬病活疫苗规程进行检验.结果显示,3批收获的病毒液滴度平均达1050LD50/0.03 mL;3批实验疫苗检验结果均符合质量标准.实验证明激流式生物反应器纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗提高了细胞密度、病毒滴度,增加了病毒液收获体积,减小了批间差,保证了产品均一性,适合工业化大生产. 相似文献
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试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达107.0 TCID50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。 相似文献
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为了实现在幼地鼠肾细胞(BHK-21细胞)低血清全悬浮培养工艺下获得更高含量的口蹄疫病毒(FMDV),试验对比了4株不同来源的BHK-21悬浮细胞的培养特性,按体积1%、2%和5%分别接种O型、A型FMDV,接种后4,8,12,16,20,24小时取样进行146S、半数致死量(LD50)对比研究,筛选形态良好、培养特性更稳定的BHK-21悬浮细胞株;以摇瓶悬浮培养筛选得到的BHK-21悬浮细胞株,使用O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株,从接种剂量、活细胞密度(VCD)、病毒培养温度、病毒培养pH值、换液体积比例等工艺参数对病毒146S表达的影响进行了研究,并在7.5,50,500 L生物反应器中逐级放大,进行了O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株各3个批次病毒液悬浮培养研究,确定O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMDV AF/72株接种BHK-21悬浮细胞的培养工艺。结果表明：筛选得到1株形态良好、培养特性更稳定的BHK-21-CP005悬浮细胞株;O型FMDV O/HB/HK/99株、A型FMD... 相似文献
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本文主要研究了利用生物反应器Tide-Cell微载体培养的BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株工艺。总数为1×1010个BHK-21细胞接入装有500 g BioNOCTMⅡ型载体的Tide-Cell培养系统,最适条件下培养120 h。当细胞培养系统中葡萄糖消耗量达到8 g/(L·h)左右,细胞数达到4×1011时,按照MOI为1接入Flury株病毒。一批至少可以收获10次(50 L/次)毒价高于107.5TCID50/mL的抗原液,其中包含5次毒价为108.0TCID50/mL的抗原液。提高抗原液病毒含量有助于提升狂犬病灭活疫苗效价,从而降低生产成本。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。 相似文献
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从吉林省长春市某猪场送检的一头发热、流涎、肌肉痉挛、角弓反张的9日龄仔猪中分离到一株病毒。该病毒能在猪肾细胞(PK-15),仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖并产生典型的细胞病变(CPE),从流行病学,临床症状和病理变化均与伪狂犬病相似,该病毒能被伪狂犬病毒阳性血清中和,电镜观察可见椭圆形、直径为110-180nm典型疤疹病毒粒子,用该病毒接种家免和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。经鉴定,证明此病毒确为伪狂犬病病毒(PRV),并将该病毒命名为PRVCC株。 相似文献