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1.
贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为适应进口鲜活水产品的快速检验,有必要建立快速检测多种病原生物的方法。本文针对鲜活水产品中常见的副溶血弧菌和沙门氏菌,设计了特异的荧光引物,建立了检测贝类中这两种细菌的荧光定量PCR体系,并进行了特异性与重复性试验。结果表明,在相同的反应条件下,副溶血弧菌和沙门氏菌均得到了特异性扩增,而阴性对照菌株均未见扩增。副溶血弧菌标准曲线在1.53×105~1.53×109拷贝/μL之间、沙门氏菌标准曲线在4.89×106~4.89×1010拷贝/μL之间有较好的线性关系。与传统的检测方法相比较,该荧光定量PCR方法检测贝类中的副溶血弧菌和沙门氏菌更为快速准确,结果直观,可以满足口岸进口水产品快速检测的需要。 相似文献
2.
为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
3.
《中国动物传染病学报》2015,(6)
根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。 相似文献
4.
为了实现副溶血弧菌的现场快速筛查,降低副溶血弧菌引起的食品安全问题,保障食品安全,试验利用副溶血弧菌tdh基因建立了可以快速检测水产品中副溶血弧菌的恒温环介导扩增(LAMP)方法,并通过添加钙黄绿素实现现场快速判定水产品中是否存在副溶血弧菌,同时利用建立的方法对螃蟹及贝类共40份水产品进行检测。结果表明:试验建立的方法具有良好的特异性,灵敏度可达7.92×10~(-3) ng/μL,实时浊度仪观察只有副溶血弧菌扩增出曲线,采用钙黄绿素法观察只有副溶血弧菌的扩增体系见到黄绿色。检测方法初步应用结果显示,从1例板蟹和1例蛤蜊中检测到副溶血弧菌核酸,证实2例水产品中存在副溶血弧菌。说明试验建立的方法可用于水产品中副溶血弧菌的现场检测。 相似文献
5.
依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法.特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应.此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测.该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景. 相似文献
6.
实时荧光PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
目的建立快速检测水产品中副溶血性弧茵的实时荧光PCR方法。方法利用副溶血性孤菌TDH基因的保守序列设计引物和探针,建立快速检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法。结果本研究建立的检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法,其纯茵检测低限低于10cfu/PCR反应体系;对模拟阳性样品直接检测,检测低限为10~3cfu/g。模拟样品经增茵培养4～6h后,检测低限达1cfu/g;用本法对24株标准菌株/参考菌株进行检测,结果除副溶血性弧菌呈阳性外,其他23株非副溶血性弧菌均呈阴性反应;重复性试验结果:批内和批间变异系数均小于1%。结论本研究建立的副溶血性弧菌实时荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的优点,可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测。 相似文献
7.
基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 相似文献
8.
为建立一种快速高效的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物（SX4）,建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×101 copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。 相似文献
9.
为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法.优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果... 相似文献
10.
用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。 相似文献
11.
为建立快捷、准确、高效检测副溶血弧菌的方法,以副溶血弧菌种属特异性基因toxR和毒力因子tdh、trh基因序列,分别设计3对特异性引物及相应TaqMan探针,并在toxR、tdh和trh基因的3个探针的5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端标记BHQ1淬灭荧光基团,通过优化反应体系和反应参数,确定最佳反应体系,建立一种基于Taq Man探针定量检测副溶血弧菌的三重荧光定量PCR方法。结果:本试验所建立三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限亦达到10 CFU/m L,且整个检测扩增时间大约为1 h。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好且耗时短,是高通量检测致病性副溶血弧菌的有效手段。 相似文献
12.
为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。 相似文献
13.
为建立检测梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,本研究根据MVV核苷酸保守序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有MVV目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105～5.0×101拷贝范围内定量PCR均有S型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝。对羊的其他病毒核酸均无扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高,特异性好,在MVV的快速检测中具有良好的应用前景。 相似文献
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舟山沿海贝类产品中副溶血性弧菌的检测与毒力基因分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解舟山沿海贝类产品中副溶血性弧菌污染情况,我们于2008年3个不同季节,从不同的农贸市场采集贝类标本,采用实时荧光定量PCR检测方法和常规培养方法,对舟山沿海贝类产品中的副溶血性弧菌进行了检测,同时对分离到的菌株进行血清学分型和毒力基因检测。结果60份贝类产品中,采用常规的分离培养方法,阳性率为83.33%,而采用实时荧光定量PCR检测方法,全部检出副溶血性弧菌。对分离到的50株副溶血性弧菌进行耐热溶血素(tdh)基因检测,结果4株tdh阳性。监测结果表明舟山贝类海产品中携带副溶血性弧菌情况比较严重,应引起足够的重视。 相似文献
15.
为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同) PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×101拷贝/μL～8.3×108拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I ... 相似文献
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实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。 相似文献
18.
《中国动物传染病学报》2016,(1)
霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌是引起全球范围的食源性疾病的重要病原菌,建立一种能准确鉴别这3种弧菌的方法具有重要意义。groEL基因是包括弧菌属在内的多种细菌检测的分子标记。本研究根据3种弧菌的groEL基因分别设计引物,经PCR扩增及反应条件的优化,建立一种能同时检测这3种弧菌的多重PCR方法。结果表明应用多重PCR技术对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌能分别特异性地扩增出418、644、192 bp的目的片段。检测其他非目标供试菌时,不出现任何扩增条带。敏感性检测结果表明,对霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌最低检测限分别为102、102、103CFU/m L。人工染菌水产品检测结果显示,所建立的多重PCR方法能够有效检测出目的细菌,而未染菌组均为阴性。本文通过建立的多重PCR方法实现了对这3种弧菌的同时检测,具有快速、灵敏度高和特异性强等优点,对水产品中这3种弧菌的检测和流行病学调查具有重要意义。 相似文献
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荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tdh基因的表达差异 总被引：2，自引：0，他引：2
以pvuA为内标基因,运用实时荧光定量PCR检测不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因tdh的表达量。pvuA和tdh基因的荧光定量PCR融解曲线分析表明,两者均为特异性扩增。尽管相同来源的不同菌株间tdh表达量存在显著差异,副溶血弧菌临床分离株的tdh mRNA平均表达量显著高于海产品分离株((57.2比13.8)。在pH4.0、0.5%和8%NaCl应激条件下,临床株ZJ2和海产品分离株FJ14A的tdh mRNA表达量显著高于对照组;另一海产品分离株KP34在8%NaCl条件下的表达量显著提高,而低pH应激时tdh mRNA的表达量显著降低。结果表明,不同副溶血弧菌分离株的tdh mRNA表达差异显著,临床分离株的tdh mRNA表达量总体上高于海产品分离株,副溶血弧菌在不同应激条件下主要表现为tdh mRNA表达上调。 相似文献
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为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。 相似文献