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1.
《中国兽医学报》2015,(11):1759-1764
为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白抗IBDV活性,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeⅠ酶切线性化,电穿孔方法导入酵母Pichia Pastoris X-33感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,淋巴细胞转化试验初步检测表达产物生物学活性,鸡胚接种试验对表达产物的抗IBDV效果进行评价。结果表明,在酵母培养上清液中存在相对分子质量分别为22 000、23 000和43 000的目的蛋白,表达的IL-18和IFN-α-IL-18对鸡淋巴细胞具有明显的诱导转化作用(P0.05)。IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P0.05)。这为进一步开展IFN-α-IL-18融合蛋白的功能研究及其在鸡病毒性疫病防控中作用的探索奠定了基础。 相似文献
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本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素(IFN-γ)基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1-6位氨基酸为胞内区域,7-28位氨基酸为跨膜区域,29-167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(58.08%)和无规则卷曲(33.53%)为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。 相似文献
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为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。 相似文献
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为了分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)后,对其细胞因子IL-17、IL-18和IFN-γmRNA转录水平的影响,探讨禽呼肠孤病毒感染机制和宿主之间的作用关系。本试验将ARV-S1133感染CEF细胞后,运用荧光定量PCR技术,测定和分析ARV结构蛋白σC和CEF细胞的IL-17、IL-18及IFN-γ的mRNA动态转录水平。结果表明,ARV-S1133感染CEF细胞10h后病毒结构蛋白σC mRNA的相对表达量开始迅速上升,在48h达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF细胞中的IL-17、IL-18和IFN-γmRNA表达量发生变化,IL-17和IFN-γmRNA转录水平在感染早期迅速上调,感染后6h达到第一个峰值,分别上调8.77倍和11.17倍,随后下降,在感染36、48、60h后大幅度上升,且在48h达到峰值,表达量分别为97.19倍和111.58倍。IL-18mRNA转录水平在整个感染过程中表达量较低,在感染6h后微量上调(1.39倍),在感染中后期,其表达量呈下调趋势,感染48h时,IL-18mRNA表达量最低,与对照组相比下调0.19倍;5个不同滴度的ARV病毒感染CEF细胞24h后,3个细胞因子mRNA的表达量与病毒滴度线性相关,IL-17和IFN-γmRNA转录水平与病毒滴度正相关,IL-18mRNA转录水平与病毒滴度负相关。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-17、IL-18、IFN-γ的mRNA转录水平上调,说明IL-17、IL-18、IFN-γ可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。 相似文献
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鸡白介素18基因原核表达质粒构建 总被引：7，自引：0，他引：7
根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础 相似文献
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应用RT—PCR技术分别从脂多糖（LPS）活化的牛脾脏细胞和肺泡巨噬细胞中克隆到编码牛白细胞介素（bIL）18成熟蛋白的cDNA基因，其大小为480bp。将bIL-18克隆到pET32a（＋）质粒中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析．得到了分子量为38ku的融合蛋白，该蛋白经纯化并复性后，具有诱导MDBK分泌IFN-γ的活性，并且可以刺激ConA活化的外周血单核细胞（PBMC）增殖。使用半定量RT—PCR对其mRNA的体内表达进行了测定，发现不论是否加入刺激剂，牛巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA，但是被LPS活化的PBMC只有微弱表达，肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达，其水平明显高于PBMC，在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18的能力。 相似文献
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为了研究重组羊白细胞介素(gIL)-18在酵母系统中的高效表达,进一步阐明该重组蛋白的生物学活性,以含有gIL-18基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,构建重组表达质粒pPICZ-gIL-18,转化于毕赤酵母GSll5,以甲醇诱导表达,经sDS-PAGE和western blot分析证实了重组蛋白的表达,分泌的重组gIL-18表达量为100 mg/L.经纯化后用MTT法和MDBK-VSV法检测表达的重组IL-18体外生物活性,利用免疫试验检测了重组蛋白对羊痘疫苗的免疫增强作用.实验结果表明,该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性,比活性为1.5×105 u/mg.体外具有增强羊痘疫苗的活性.毕赤酵母分泌表达的重组gIL-18具有良好的生物学活性,为gIL-18作为免疫佐剂和免疫治疗剂的大规模应用奠定了基础. 相似文献
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白细胞介素18研究进展 总被引：3，自引：0，他引：3
白细胞介素18(IL-18)是IL-1细胞因子家族成员,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌,其基因结构、合成表达、受体与信号转导等方面比较特殊,IL-18具有多种生物学功能,特别是具有诱导产生IFN-γ的强大功能,它在先天及后天的免疫应答调节中发挥重要作用,在刺激T细胞增殖、增强Th1型反应、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等活性,抗肿瘤、免疫调节等方面有着积极的作用.对IL-18的生物学特性的研究发现,它在某些疾病病理状态,包括自身免疫及感染中作为潜在的效应因子而发挥调节作用. 相似文献
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白细胞介素18（IL-18）是一种能诱导IFN-γ产生的新型细胞因子。它具有多种生物学功能．能诱导Th1细胞和自然杀伤细胞产生干扰素γ，促进T淋巴细胞和自然杀伤细胞表达FasL，有较强的抗肿瘤和抗微生物感染的作用。 相似文献
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通过筛选出黄曲霉素解毒酶(ADTZ)基因片段,采用鼠的黏蛋白启动子(MUC)成功构建了ADTZ基因肠道特异性表达载体(MUC-ADTZ-LV),并利用原核注射法制备了肠道特异性表达ADTZ转基因小鼠。PCR和Southern blot鉴定结果显示,成功制备了6只携带肠道特异性表达ADTZ基因转基因小鼠。RT-PCR结果显示,ADTZ基因仅在小鼠肠道中进行了特异性表达。肠液中ADTZ的活性为(4.62±1.54)U/mL。在饲料中添加黄曲霉毒素并对小鼠进行14d的喂养试验,之后对血清生化指标及小鼠血清和肝脏中黄曲霉毒素的残留进行了测定。结果表明,转基因组血清中总蛋白(TP)和球蛋白(GLP)的含量显著高于阳性对照组,而转基因组血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量显著低于阳性对照组(P0.05)。转基因组小鼠血清和肝脏中黄曲霉毒素的残留量显著低于阳性对照组小鼠血清和肝脏中黄曲霉毒素的残留量。本试验在转基因小鼠的肠道中成功生产了ADTZ,并降低了饲料中黄曲霉毒素对小鼠毒性的影响。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(12):1931-1934
为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。 相似文献
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本研究以重组病毒rSj14NPV为感染病毒,通过比较纯化蛋白的产量,对家蚕作为生物反应器生产基因工 程产品的适宜蚕品种与相关的重组病毒接种技术进行了比较研究。研究结果表明:871×872、秋风×白玉为表达 Sj14的适宜蚕品种;重组病毒接种量与蛋白表达量有关,适宜接种量为4～5μL/蚕;适宜接种时间以5龄2日龄为 优;以家蚕表达外源基因,最好将重组病毒以家蚕细胞复苏后再接种家蚕以保证获得较高的表达效果。 相似文献
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Karasawa K Tanaka A Jung K Matsuda A Okamoto N Oida K Ohmori K Matsuda H 《Veterinary journal (London, England : 1997)》2011,190(2):e72-e77
Aquaporins (AQPs) function as water channels in many types of cells involved in fluid transport. More than 10 isoforms have been identified, and these are differentially expressed in many types of mammalian cells in the body. Six AQPs (AQP0, AQP1, AQP3, AQP4, AQP5, and AQP9) have been identified in the eyes of humans and/or rodents. The unique permeability characteristics and distribution of AQPs indicate their diverse roles in the regulation of water homeostasis in the eye. The aim of this study was to investigate the localisation of AQPs in normal canine eyes, with AQP0 protein expressed in the crystalline lens and retina. Although AQP1 mRNA was detected in various areas of the canine eye, its protein expression was limited to the cornea, iris and ciliary body. AQP4 was identified in the iris, retina and optic nerve. AQP3 and AQP5 were found in the cornea and conjunctiva, and their expression was particularly high in the limbus. AQP3 and AQP5 were present in the nictitating membrane indicating that they play a role in water transport within the membrane. The observations suggested that several subtypes of the AQP family are involved in the regulation of water homeostasis in the canine eye. 相似文献
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《中国兽医杂志》2017,(9)
为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。 相似文献
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以不同发情周期雌性绵羊子宫、输卵管为研究对象,采用免疫组织化学技术,针对血管内皮生长因子（VEGF）在绵羊子宫、输卵管的表达、定位和变化规律进行了检测,同时应用相关图像分析软件对抗原染色强度进行了定量分析。结果表明：输卵管在发情0～15d,VEGF表达量在第9天达到峰值后经历波动逐渐下降过程,输卵管内膜上皮细胞是VEGF抗原的主要靶细胞;而子宫角在发情0～15d,VEGF表达量在第5天达到峰值后经历波动逐渐下降过程,子宫内膜固有层及腺体周围细胞为VEGF抗原的主要靶细胞。该研究结果为绵羊生产中进一步提高受胎率和妊娠率及频密产羔等技术的应用提供了科学依据。 相似文献
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基因表达是指编码某种蛋白质的基因从转录、mRNA的加工与成熟、RNA的翻译、蛋白质的加工到活性（功能）蛋白质形成的过程。基因表达受到严格的调控,包括转录调控、RNA加工调控、RNA转运调控和翻译调控、mRNA稳定性调控及翻译后的调控。每一个调控点都与养分直接或间接有关。营养和基因表达的一般关系表现为两个方面：一是养分的摄入量影响基因表达;二是基因表达的结果影响养分的代谢途径和代谢效率,并决定营养需要量。 相似文献
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将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋），并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点，构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），优化诱导条件，使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明，V13KL基因成功克隆并且获得表达，在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。 相似文献