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目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。 相似文献
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为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10-4至2.56×10-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。 相似文献
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禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选,获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明,8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达1∶3.2×103~1∶5.1×106,其中2株HI效价达212。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝,与减蛋综合征(EDS-76)病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)均不反应。亚类鉴定证实,除1C7单抗为IgG2b外,其他7株均为IgG1亚类。Westernblotting试验分析初步表明,8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原,其中3株针对核蛋白(NP),2株针对基质蛋白M1,2株针对血凝素HA/HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致,其中1株未明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。 相似文献
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本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀 H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过 H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感 H9N2亚型病毒进行 HA 基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉 HI 效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉 HI 效价及中和效价最高。HI 试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感 H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支 H9疫苗株联合更有利于控制 H9型禽流感, 相似文献
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为了对供港猪群中的猪流感流行情况进行分析,从华南地区供港猪群中用无菌棉拭子采集鼻腔粘液样品,采用鸡胚接种方法,从供港猪群中分离出了2株不同亚型的猪流感病毒株,经国家流感中心鉴定分别为H1N1和H3N2亚型。本研究设计了猪流感常见亚型的HA和NA分型特异性引物,建立了猪流感型特异性RT-PCR检测方法;对分离鉴定的2株猪流感病毒和禽流感H5N1 HI检测抗原进行了RT-PCR检测,并对其部分HA和NA基因进行克隆测序分析。对供港猪群的血清检测结果表明:供港猪群中H1N1和H3N2亚型抗体阳性率分别为26.87%、38.26%,禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性率均为0%。 相似文献
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为了了解2012年分离自上海发病鸡群的H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIS）的遗传变异特征,采集发病鸡群中病死鸡气管、肺、脑和肾脏等内脏,经实验室诊断为H9亚型禽流感病毒核酸阳性。将阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了3个分离株的8个基因片段并进行了序列分析。3株分离株均为H9N2亚型禽流感病毒,与以往从上海地区健康鸡群中分离的4株H9N2毒株相比,本研究中的3株分离株由于HA基因220位的氨基酸发生了变异,缺失了HA上218~220位的一个潜在的糖基化位点,并且HA基因受体结合位点的左缘235位发生了变异。从HA基因抗原位点的分析表明,与疫苗株Ck/SD/6/96相比,这3株H9N2亚型禽流感病毒7个抗原位点中已有4个发生了改变。遗传发生关系表明这3株分离株均属于Ck/Bei/1/94系,与08年的分离株Ck/SH/Y1/088个基因片段所属基因型相同。2012年上海地区发病鸡群中分离的上述3株H9N2禽流感病毒基因序列已发生变异,是否导致其生物学特性发生改变以及目前使用的疫苗能否给禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。 相似文献
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本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A／Chicken／Shandong／6／1996（CK／SD／6／96）免疫6周龄BALB／c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合。采用血凝抑制（HI）和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK／SD／6／96的HI效价分别为2^6、2^4、2^1和2^12、2^10、2^7。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原住点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(3)
为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌抗H1N1 SIV HA蛋白的MAb杂交瘤细胞株(10H8)。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG2a。MAb 10H8细胞上清和腹水的IPMA效价分别为11 024和151 200,腹水血凝抑制(HI)效价为13log2。Western blot试验结果显示MAb 10H8能够特异性地结合HA蛋白。病毒中和试验结果显示MAb 10H8杂交瘤细胞培养上清原液和1640稀释的腹水均能够抑制H1N1亚型SIV感染细胞,对SIV具有较强的中和活性。HA蛋白合成多肽的dot-blot鉴定结果显示,MAb 10H8识别的线性抗原表位为295KCQTPHGALKGNLPFQ310。本研究为H1N1亚型SIV诊断试剂和新型疫苗研发奠定了基础。 相似文献
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《中国家禽》2017,(21)
1994年以来,H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在中国广泛流行,给养禽业造成了巨大损失。病毒已表现出明显的遗传和抗原多样性,但是对于其抗原性的演化研究较少。本研究选取2014年H9N2亚型AIV分离株A/chicken/Jiangsu/TM118/2014制备针对其血凝素的单克隆抗体,共获得8株稳定分泌针对血凝素蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为4B6、3F2、6D11、6B5、1H6、1G6、2D11、3D2,腹水HI效价在2~(11)~2~(19)之间;特异性鉴定结果显示,8株单克隆抗体仅特异针对H9亚型禽流感病毒,而与其他亚型禽流感病毒及其他感染家禽的常见病毒不反应;广谱性分析显示,6D11可以与所选毒株的绝大部分反应,其它7株与不同年代、不同谱系的反应性不同;8株单克隆抗体均能与感染H9亚型禽流感病毒的MDCK细胞特异性反应,呈现绿色荧光。本研究所获得的单克隆抗体可在H9亚型禽流感病毒的抗原性位点分析、流行病学监测及临床检测中发挥重要作用。 相似文献
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为了解上海市鸭群中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的遗传变异特征,以及与疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离,对2007年和2009年分离自上海市鸭气管和泄殖腔样品采用荧光RT-PCR检测,将H9亚型禽流感病毒核酸阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定血凝素（haemagglutin,HA）亚型,随后进行了全基因测序,并结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明：3株分离毒株为H9N2亚型鸭禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒特征,均属于经典的H9N2 Ck/Bei群系;NA基因均属于Y280系;NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亚型）归为一群;PB2和M基因属于Qa/HK/G1/97系;NS基因仍为Ck/Bei系;2007年的分离株和2009年的分离株在PB1基因上分属不同亚群。3株病毒的HA1基因与疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离均大于7%。由此可见,3株鸭H9N2亚型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物,现有疫苗对分离株的保护性需要进一步评估。 相似文献
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H9N2亚型禽流感持续在我国鸡群中广泛流行,为了明确2017年山东省聊城市一肉鸡场H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异情况,对6株H9N2亚型病毒分离株进行了基因扩增、序列测定和进化分析,并分别使用病毒分离株和疫苗株抗原进行血凝抑制试验,比较免疫鸡血清的抗体效价差异。结果如下:NCBI Blastn分析表明,与各分离株基因同源性最高的序列分别来源于山东、河北、上海、江苏、浙江、江西、湖南、广东和日本等地的分离株,表明H9N2亚型禽流感病毒传播范围广,基因重排活跃。各基因的系统进化分析表明,分离株的8个基因片段分别与禽流感病毒欧亚分支的A/duck/HongKong/Y280亚系、A/quail/HongKong/G1/97亚系以及A/chicken/Shanghai/F/98亚系进化关系密切。从病毒基因型上来分析,6株病毒均隶属于2010年以来在国内鸡群中广泛流行的G57基因型。与耐药性相关的氨基酸位点分析表明,病毒M2蛋白存在S31N变异,表明病毒对离子通道蛋白抑制剂耐药。对1 000份疫苗免疫鸡血清进行血凝抑制抗体效价的检测,发现H9N2亚型禽流感分离株抗原与疫苗用标准抗原相比,所测得的血凝抑制抗体滴度平均低1~2log2,表明二者HA抗原性略有差异。总之,2017年在该肉鸡场流行的这6株H9N2亚型禽流感病毒仍然为G57基因型,分离株的HA抗原反应性与疫苗株略有差异。 相似文献
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《中国兽医学报》2015,(11):1786-1791
对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。 相似文献
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为掌握华东地区H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的流行情况及变异程度,采集临床疑似病料和活禽交易市场家禽的棉拭子样品,通过鸡胚接种、HA和HI试验及RT-PCR等方法分离鉴定H9 AIV,对其中部分毒株进行测序和序列分析,筛选4个代表毒株免疫SPF鸡制备抗血清,利用交叉血凝抑制试验测定抗原差异性。结果如下:共分离鉴定出62株H9亚型禽流感病毒,分离率为2.02%(62/3 074)。对25株H9亚型禽流感病毒株序列分析发现,分离株属于h9.4.2.5谱系,并进一步细分为A和B亚系。 HA 基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G,符合低致病性禽流感病毒的特征。与Y280代表株 HA 基因的推导氨基酸相比,分离株受体结合位点左侧臂全部变为NGLMGR。在抗原位点92位氨基酸出现R(64%)/K(36%)的变化。交叉血凝抑制试验结果表明分离株间的HI抗体滴度相差2~8 log2,可分为2类抗原型。因此,目前流行的H9亚型AIV发生了抗原变异,至少同时存在两种抗原型。 相似文献
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本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。 相似文献
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以禽流感H5亚型病毒分别免疫BABL／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA检测细胞上清液，结果获得了3株抗禽流感H5亚型病毒特异性单克隆抗体，分别命名为186，1D4，7D1；其中1D4株为抗禽流感H5亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株．186株和7D1株为针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体细胞株。经3次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒抗体的能力。这些单克隆抗体小鼠腹水ELISA效价为10^5，HI效价为2^11-12。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与相应的禽流感病毒株发生特异性反应，而不与鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、鹅副粘病毒等反应。所有这些单抗在禽流感诊断中将发挥重要作用。 相似文献
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以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。 相似文献
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为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chickeen/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3.MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为k链.经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性. 相似文献